Электрофорез условия разделения смесе

Данные фронтального электрофореза часто помогают правильно выбирать условия и идентифицировать белковые компоненты при разделении смесей в зональном электрофорезе. [c.63]

Как и в электрофорезе, скорость движения ионов на бумаге под действием электрического поля пропорциональна приложенному потенциалу. Лучшее разделение компонентов смеси происходит при высоких потенциалах. Но ве-пичина потенциала ограничена тем, что при большой силе тока бумага разогревается и растворитель сильно испаряется. При слишком большой силе тока бумага может даже обуглиться. Для уменьшения разогрева бумаги опыты проводят на холоду или применяют охлаждающие жидкости-неэлектролиты, например хлорбензол. Чтобы избежать испарения электролита с бумаги, последнюю помещают между двумя стеклянными пластинками. При прочих равных условиях подвижность ионов увеличивается с повышением температуры. [c.316]

I Как будет показано ниже, существующие теории дают только самые общие рекомендации для выбора условий при электрофоретическом разделении смесей, и каждую конкретную новую задачу приходится решать методом проб и ошибок. Хотя многие задачи уже решены, литература по электрофорезу очень обширна, и охватить полностью даже важнейшие работы здесь невозможно. В данной главе ставилась лишь задача дать представление о наиболее широко распространенных методах электрофореза, их преимуществах и недостатках и областях применения. Дальнейшие подробности и ссылки можно найти в многочисленных обзорах, на которые в основном мы будем ссылаться. [c.42]

Т а б л и ц а 4.1 Условия разделения смесей электрофорезом на бумаге [c.176]

Задача электрофореза в большинстве случаев заключается не в идентификации ионов, образующихся в результате электролиза, и оценке их распределения, а в определении скорости миграции к электродам добавляемых заряженных частиц. При условии, что расстояние между электродами достаточно велико, разницу в скоростях движения индивидуальных частиц можно использовать для разделения смесей. Применяют два метода электрофореза метод свободно движущейся границы — фронтальный электрофорез и зонный электрофорез. [c.465]

Обычно считают нецелесообразным повторять фракционирование сульфатом аммония в одинаковых условиях несколько раз подряд. Но если варьировать температуру или pH, то порядок, в котором будут осаждаться различные белки, может измениться. В таком случае целесообразно проводить фракционирование последовательно, при разных условиях. Иногда для разделения системы используют различные соли последовательно или в виде смеси. Так, известен метод, в котором обезжиренную муку земляного ореха экстрагировали 10%-ным хлористым натрием при рН = —6,0, а затем из осветленного экстракта белки фракционировали с помощью сульфата аммония. Чтобы выделять отдельные ферменты, солевое разделение можно использовать и само по себе, и в комбинации с иными способами, с воздействиями, основанными на иных принципах. Сочетаются, например, высаливание, адсорбционные способы и электрофорез, спиртовое разделение фракций и затем их солевая очистка, дробное высаливание и электрофорез и т. п. [c.148]

Разделение сложных смесей на бумаге методами хроматографии или электрофореза в одном направлении не всегда приводит к получению чистых веществ. Очевидно, что для увеличения рабочего поля, на котором распределяются вещества, хроматографию или электрофорез (или их комбинацию) выгоднее проводить в двух взаимно перпендикулярных направлениях. При проведении такого двумерного разделения в одинаковых условиях по обоим направлениям все компоненты распределяются по диагонали рабочего поля. Для использования всего имеющегося поля условия разделения во взаимно перпендикулярных направлениях должны отличаться. Поэтому двумерный электрофорез проводят при различных pH, а двумерную хроматографию — в различных буферных системах. Комбинированный способ разделения веществ, когда в одном направлении проводится электрофорез, а в перпендикулярном ему — хроматография, по своему значению стоит на первом месте. Менее гибок метод двумерной хроматографии, еще меньшее значение имеет двумерный электрофорез. [c.234]

В работе [226] найдены условия отделения прометия от больших количеств соседних элементов методом непрерывного электрофореза. На рис. 85 а и б) приведены хроматограммы, полученные при разделении смесей, в которых отношение содержания Ей Рт и Се Рт составляло 10 1, в растворах 0,7 М винной кислоты и 0,7 М а-оксиизомасляной кислоты с pH 2,2 при падении напряжения 90 в/см и силе тока 5 ма. Время разделения 30 мин. Этот метод применен также для отделения Рт от больших количеств Ыд при их соотношении 1 10 . [c.169]

Разделение исходной границы на две или большее число границ с помощью седиментации или электрофореза показывает, что исследуемый образец содержит по меньшей мере столько же компонентов, сколько имеется границ. (При надлежащей технике проведения эксперимента [121] можно устранить возникновение ложных движущихся границ.) Если образец содержит компоненты, не поддающиеся разделению данным методом в примененных условиях, то число границ, естественно, может быть меньше, чем число компонентов. В идеальных условиях разделения и наблюдения можно открыть компонент, количество которого в смеси не превышает 1 %. [c.25]

В первоначальных экспериментах меченные по одному концу продукты реакций химической деградации разделяли электрофорезом в 20%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с 7М мочевиной в трис-боратном буфере. Для успешного разделения смеси олигонуклеотидных фрагментов, отличающихся на один нуклеотид, применяли плоские пластины гелей толщиной 1,5 мм и размером 30 на 40 см, что обеспечивало необходимое разрешение и соответствовало имеющимся рентгеновским пленкам с размерами 35,5 на 43 см (или 30 на 40 см для отечественных). Для эффективного разделения градиент напряжения составлял около 30 V на см длины геля. После завершения электрофореза стекла разъединяли и гель с одним стеклом, используемым [c.40]

В некоторых случаях перед разделением опытных смесей до добавления белка предварительно проводят электрофорез, при котором удаляются побочные продукты полимеризации, которые могут ухудшить электрофоретическое разделение, а также персульфат аммония, который ингибирует активность некоторых ферментов Условия предварительного электрофореза сила тока — 3—5 мА, напряжение — 200—400 В, продолжительность — около 60 мин [c.96]

Каждую из четырех смесей фрагментов подвергают электрофорезу на пластинке геля в условиях, обеспечивающих разделение фрагментов в соответствии с числом содержащихся в них нуклеотидных остатков независимо от того, какие это остатки. При таком разделении фрагменты будут двигаться тем быстрее, чем они меньше. Точное положение каждого меченого фрагмента в геле определяют радиоавтографией. Положения меченых фрагментов в каждом из [c.888]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Уравнения 4 и 5 справедливы лишь при условии, если размер частиц велик по сравнению с толщиной двойного электрического слоя (5"). Для полуколлоидных систем и молекул белков, где размеры частиц могут быть того же порядка, что и толщина двойного слоя, величина электрофоретической подвижности зависит от размеров частиц. На этом основано разделение сложных смесей белков и др. веществ при их электрофорезе. Методика такого разделения была разработана Тизелиусом. [c.159]

Преимуществами тонкослойного электрофореза по сравнению с электрофорезом на бумаге являются возможность разделения и выделения весовых количеств индивидуальных компонентов смеси и, следовательно, их химический и физико-химический анализ легкость регенерации порошка хорошая воспроизводимость условий и результатов эксперимента. [c.68]

Для разделения смеси полисахаридов, а также установления их однородности можно использовать электрофорез в боратном буфере на хроматографической бумаге. Поскольку полисахариды в значительной степени отличаются по химическому составу, способности образовывать комплексы с боратами, величине молекулярного веса и растворимости, подвижность их в электрическом поле не одинакова и условия электрофореза для разделения различных смесей не являются стандартными. Например, скорость миграции глюкоманнанов в боратном буфере при pH 9,3 значительно выше, чем глюкуроноксиланов. Эти полисахариды легко разделяются в течение 4—6 ч при напряжении 20—25 в/см. Смесь, состоящая из 4-0-метилглюкуроноарабоксилана, галактуроноарабогалак-тана и арабана, вследствие близких значений подвижности разделяется с большим трудом в этом случае электрофорез занимает [c.50]

Электрсфсрез. Электрофорез является важным методом разделения смесей полисахаридов, хотя широкому его использованию препятствует трудность подбора условий эффективного разделения. [c.487]

В этом методе электрофореза используется электрофоретическое перемещение макромолекул в среде с градиентом плотности пор геля. Конечный результат — разделение смеси на отдельные компоненты в соответствии с размерами молекул, при этом электрофоретическая подвижность не играет существенной роли. Необходимым условием такого разделения является наличие у исследуемых соединений зарядов одного типа и отличной от нуля электрофоретической подвижности в применяемой среде. Движение веществ от старта постепенно тормозится вследствие уменьшения пор геля, и с увеличением расстояния от старта подвижность макромолекул постепенно уменьшается. При больших молекулярных массах нодвил ность уменьшается почти до нуля. Ограничение подвижности, вызываемое гелем, приводит к фокусированию зон. Для того чтобы подвижность снижалась до нуля, наряду с градиентом концентрации акриламида необходимо наличие градиента степени сшивки геля. Поэтому в новых типах гелей имеется градиент концентраций и полиакриламида, и бисакриламида. На этих гелях можно разде- [c.299]

При проведении электрофореза в буферных растворах с различными значениями pH выяснено, что для разделения смеси сульфо- и бромсульфофталеиновых индикаторов наиболее подходящим является раствор с величиной pH 6,5, так как подвпжнбсти индикаторов в этих условиях наиболее отличны друг от друга. [c.76]

Несмотря на то что полиакриламид стал применяться в качестве носителя для электрофореза лишь после 1960 г., этот материал в настоящее время наиболее широко используется при разделении смесей макромолекул кислого или основного характера. Сейчас полиакриламидный гель как носитель практически вытеснил бумагу и крахмальный гель, поскольку в случае белков и нуклеиновых кислот он дает очень хорошее разрешение. Гель получают полимеризацией акриламида в присутствии метиленбисакриламида или других соединений, служащих сшивающими агентами. В работе Сарджента [3] подробно описаны способ получения гелей, процедура нанесения пробы и условия разделения. [c.138]

Заслуживает особого внимания применение противоточного капиллярного электрофореза для количественного анализа сложных смесей неорганических ионов но Константинову и Ошурковой [75—77]. Разделение смеси катионов или анионов проводят в тонких капиллярах с внутренним диаметром 0,1—0,2 мм и длиной 10—15 см нри градиенте потенциала 30—50 в/см. Разделяемую смесь помещают в среднюю горизонтальную часть капилляра между индикаторными растворами. Этими же растворами заполняют также катодное и анодное отделения. Подвижности ионов в индикаторных растворах должны удовлетворять основному условию, согласно которому к> г> а, где к — ПОДВИЖНОСТЬ катиона католита Ыа — подвижность катиона анолита г — подвижность кэтионов В смеси. Характерно, что концентрация индикаторных растворов мо- [c.52]

Для электрофореза можно использовать один буферный раствор определенного состава ( непрерывный буфер) либо систему из двух буферных растворов ( ступенчатый буфер). В последнем случае собственно разделению образца на компоненты предшествует стадия его концентрирования в виде узкой стартовой зоны на границе раздела буферов (ступенчатый электрофорез). Если разделение проводится в трубках с полиакриламидным гелем, образующиеся зоны имеют форму дисков. В условиях изотахофореза [50] мигрирующие вещества образуют соприкасающиеся друг с другом зоны, которые расположены между лидирующим и замыкающим электролитом. Чтобы эти зоны не соприкасались, в исходную смесь добавляют вещества- разделители (spa ers), которые по своей электрофоретической подвижности занимают промежуточное положение между двумя наиболее близкими по этому параметру компонентами смеси. Таким образом, изотахофорез в опре- [c.28]

Для анализа смесей кислых полисахаридов может с успехом применяться электрофорез в аппарате Тизелиуса. Таким путем, например, отделяют сульфированные полисахариды от полиуронидов водорослей при низких рН . Разделение нейтральных полисахаридов проводят в боратном буфере в условиях, при которых полисахариды различаются по способности образовывать комплексы с борной кислотой . Таким способом удалось легко отделить маннан от глюкана в водорастворимой фракции полисахаридов andida albi ans . [c.487]

Для большинства методов этой группы характерно отсутствие четкой границы в приложении к разделению гомогенных и гетерогенных смесей веществ. Например, электрофорез возник и до сих пор иногда рассматривается только как метод разделения коллоидных частмп. Более того, по сути своей — это метод разделения заряженных частиц за счет их различных подвижностей в электрическом поле. В общем случае размеры частиц не оговариваются, и область применения метода охватывает и простые ионы, и макроионы аминокислот, и заряженные частицы коллоидов и взвесей. Аналогично обстоит дело с ультра-центрифугированием и ППФ-методами. Даже в тех случаях, когда метод имеет достаточно четкие границы применимости по размерам или массам разделяемых частиц, их положение на условной щкале дисперсности частиц различной природы не пршязано к принятой границе гомогенности, Существование верхней границы чаще всего определяется принципом целесообразности если задача легко рещается более простым методом, нет необходимости использовать более сложный. Наличие нижней границы может быть связано как с объективными факторами, определяемыми природой явления, используемого для разделения, так и с техническими возможностями практической реализации условий, необходимых для осуществления процесса разделения. Наиболее наглядный пример — ультрацентрифугирование. Очевидно, что с помошью ультрацентрифуги можно выделить взвешенные частицы из раствора, но в этом нет необходимости. А при переходе к разделению частиц на молекулярном уровне в случае жидких фаз возможности метода ограничены фракционированием макромолекул. Добиться, фракционирования простых молекул удается только в газовой фазе, но при ус ювии ра зряжения и чрезвычайно высоких скоростей вращения, реализуемых только при магнитной подвеске ротора центрифуги. [c.242]

Особо следует отметить описанную Хонеггером [7а] в разд. 19.VI комбинацию тонкослойного ионофореза (электрофореза) с двумерным разделением при ХТС. Рис. 176 иллюстрирует успех этого метода при разделении сложной смеси аминов и аминокислот. Там же приведены условия опыта. [c.304]

Условия электрофореза напряжение 850—700 в, сила тока 8—12 ма, время фракционирования 5—6 ч. После прекращения подачи разделяемой смеси и снятия напряжения протекание буферного раствора по бумаге не прекращалось, в течение суток производили вымывание фракций, сдвинутых под влиянием электрического поля. Как и при хроматографическом разделении, для характеристики фракций применяли спектрофотометрический метод анализа. Результаты псследовачий приведены на рис. 23, е. Они описываются семейством монотонно убывающих кривых приведенных оптических плотностей с удалением пробы от вертикальной линии ввода исследуемой смеси они приближаются к абсциссе в длинноволновой области спектра. Крутизна спада спектральных кривых поглощения света, определяемая величиной отношения 48о/ 56о, для отдельных фракций следующая проба V — 3,2 проба VII — 3,4 проба X — 6,0. Таким образом, отклонение движения потока жидкости от вертикального при электрофорезе увеличивается с переходом от гуминовых кислот к фульвокислотам в связи с большей подвижностью последних в электрическом поле постоянного тока. [c.61]

Б. содержат кислые карбоксильные группы и ами-погруппы со свойствами оснований и проявляют в р-рах амфотерные свойства. При определенных значениях pH в р-рах Б. преобладает диссоциация тех или других групп, что придает частицам Б. соответств. заряд и вызывает их движение в электрич. поле (электрофорез). Электрофоретич. подвижность, выражаемая в см волътг сек -, определяется плотностью заряда поверхности молекул и при соблюдении тождественных условий может служить характеристикой Б. Электрофорез широко используется для анализа смесей В. и их разделения. Электромет-рич. титрование растворов Б. позволяет судить о природе диссоциирующих функциональных групп. Дипольный момент Б. в р-рах равен 100—1000 D (единиц Дебая), диэлектрич. инкремент (на 1 г Б. в 1 д) равен 0,1—1,0 диэлектрич. проницаемость растворов Б. всегда выше, чем растворителей. [c.193]

Гели в качестве поддерживающей среды при электрофорезе обладают рядом важных особенностей. Главная из них та, что размеры пор геля могут быть сравнимы с размерами белковых макромолекул. В этих условиях подвижность частиц очень резко зависит от их размеров. Таким образом, вводится дополнительный фактор, влияющий на разделение. Кроме того, адсорбция во многих гелях крайне мала. Но этим причинам электрофорез в гелях обладает чрезвычайно высокой разрешающей способностью по отношению к сложным белковым смесям — значительно более высокой, чем все другие методы. Это особенно выражено в крахмальном геле, предложенном Смитисом в 1955 г., и в синтетическом полиакриламидном геле, который все чаще используют в последнее время. В этих гелях, например, удается обнаружить до 30 компонентов сыворотки крови, в то время как фронтальный электрофорез дает только 5—7. Агаровый гель хотя и обладает малой адсорбцией по отношению к белкам, дает худшее разделение, так как размер пор в нем относительно велик. Но и в агаре было замечено, что отношение подвижностей больших и малых ионов уменьшается с увеличением концентрации агара (т. е. с уменьшением размера пор). [c.95]

Простая, но изящная методика высоковольтного электрофореза развилась на основе работы Виланда [1], вышедшей в 1948 г. В ряде случаев при помощи этой методики удается получить удовлетворительные результаты при разделении аминокислот или пептидов в условиях традиента потенциала 5—20 в1см, однако для разделения сложной смеси этих веществ такие условия оказываются недостаточными. Высокие скорости диффузии веществ с низким молекулярным весом ограничивают аналитические возможности электрофореза на бумаге поэтому исследователи начали проводить опыты в условиях градиента потенциала 50—200 в см. Четкая очерченность зон при таких градиентах потенциала видна на фиг. 21 и 22. [c.40]

Аркел и др. [146] анализировали мукополисахариды микро-электрофоретическим методом Виеме [147, 148]. Поскольку поступающий в продажу агар загрязнен красителями, по модифицированной [149] методике Араки [150] получают агар, не содержащий сульфата (агарозу). Электрофорез проводят в 0,9 %-ной агарозе с использованием барбитуратного буферного раствора с pH 8,6 при напряженности 20 В/см. Электрофоретическое разделение завершается примерно через 7 мин. После этого тонкослойные пластинки погружают на час в 0,1 %-ный раствор цетавлона, чтобы осадить мукополисахариды. Чтобы условия осаждения были оптимальными, Аркел и сотрудники рекомендуют использовать цетавлон в физиологических солевых растворах. Зоны разделенных соединений обнаруживают, окрашивая пластинки толуидиновым синим. С этой целью 40 мг красителя растворяют в смеси 20 мл дистиллированной воды и 80 мл сухого ацетона. Пластинки выдерживают в этой смеси 15 мин, после чего ополаскивают 1 %-ным раствором уксусной кислоты до обесцвечивания фона. Эти же авторы описали другой метод окрашивания, а также метод окрашивания белков и мукополисахаридов. [c.574]

Как видно из таблицы, в этих условиях возможно разделение не только смесей ионов ванадий (IV) — (V) и железо (II) — (III), но также, судя по подвижностям, можно ожидать успешного разделения систем ванадий (IV) — (V) — железо (III) и железо (И)—(III) — ванадий (IV). Эти разделения были выполнены на установке для препаративного электрофореза на бумаге ЭФПБ-1 при напряжении 400 в в течение 6 ч в 0,1 М растворе молочной кислоты при pH 2,8. [c.139]

Применение непрерывного электрофореза без носителя, т. е. в свободном растворе [150, 151], для разделения неорганических ионов, по-видимому, затруднительно из-за появления турбулентных, конвекционных и других потоков. По той же причине, вероятно, невозможно применение электроконвекции [152—154]. Однако для разделения разноименно заряженных ионов или нейтральных и заряженных частиц в крупном масштабе, очевидно, можно воспользоваться аппаратом Добри и Финна [155, 156]. В этом аппарате разделяемая смесь подается в виде широкой тонкой ленты в электролитный раствор, проходящий вверх в ламинарном потоке между вертикальными электродами. При наложении потенциала одна лента разделяется на несколько полос, соответствующих индивидуальным компонентам смеси, и при благоприятных условиях они достаточно хорошо разделяются и могут быть собраны в верхней части аппарата. Электроды отделяются пористыми стенками. Интересным является метод непрерывного электрофореза, описанный Колином [157], в котором конвекционные потоки исключаются благодаря электромагнитному вращению кольцевого горизонтального столбика электролита. Однако предложенный аппарат довольно сложен. [c.76]

Олигонуклеотиды можно разделять с помощью тонкослойной хроматографии или электрофореза в тонком слое или же используя оба этих метода (в разных направлениях). Оптимальные условия для разделения сложных смесей олигонуклеотидов в тонких слоях еще не разработаны. Нами установлено, что продукты частичного гидролиза синтетических полинуклеотидов и нуклеиновых кислот хорошо разделяются на тонких слоях анионообменников [32, 33]. По-видимому, весьма перспективен в этом отношении также электрофорез на тонких слоях ионообменников [34]. Недавно описан метод разделения (картирования) продуктов гидролиза РНК панкреатической рибонуклеазой (ЕС 2.7.7.16) и рибонуклеазой Т (ЕС 2.7.7.26) иа слоях немодифицированной це.плюлозы [35]. [c.46]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология