Лимитирующие разведения

Клонирование клеток методом лимитирующих разведений [c.140]

Чтобы быть уверенными, что данные клоны получены из одной клетки, а не из двух, целесообразно повторить описанную выше процедуру второй стадии метода лимитирующих разведений для каждой из трех отобранных колоний. Повторение процедуры клонирования единичных клеток имеет и то преим) ще-ство, что при проверке индивидуальных колоний, полученных после третьей стадии процедуры лимитирующих разведений, они все должны продуцировать антитела. Таким образом, гиб- [c.143]

Клонирование гибридом методом лимитирующего разведения [c.313]

Метод лимитирующих разведений — это трехстадийная процедура. Поэтому для получения клонированных клеточных линий с его помощью требуется больше времени. [c.141]

Спустя приблизительно 7 дней, когда клетки в лунках практически образуют монослой, исследуют супернатанты на содержание антител. Целесообразно протестировать неразбавленный супернатант н, если возможно, одно или два разведения (1 4 и 1 16). Из тех лунок, где антитела содержатся в наиболее высоких титрах, отбирают для клонирования единичные, наиболее жизнеспособные и хорошо растущие клетки. Выбирают две лунки, из которых клетки рассевают на второй стадии метода лимитирующих разведений. [c.141]

Вторая стадия метода лимитирующих разведений [c.141]

На первый взгляд кажется, что описанная выше процедура требует много времени. Результат оказывается наиболее хорошим, если проверяют одно или два разведения супернатанта из каждой лунки и, таким образом, оценивают титр антител. Соответственно в процессе клонирования могут быть отобраны клетки, продуцирующие возрастающее количество антител. В нашей лаборатории с целью отбора проб для приготовления разведений в нестерильных панелях для микротитрования, а также последующего переноса проб в панели для проведения РИА мы используем многоканальную пипетку. Благодаря этому исследование 48 проб из каждой панели занимает совсем немного времени. Имея соответствующие навыки, процедуру лимитирующих разведений можно осуществить за короткое время. [c.144]

Перенос в лунки ( лимитирующие разведения) [c.177]

Функционирование иммунной системы обеспечивается клетками многих типов. Совершенно очевидно, что понимание процессов иммунного ответа требует знания того, какие клетки принимают в них участие и взаимодействуют друг с другом. Один из подходов к изучению иммунной системы, которому отдавалось предпочтение в последние несколько лет, состоял в применении клонального анализа, например методов лимитирующих разведений с использованием клональных клеточных линий. Другой подход, который ни в коей мере не подменяет клональный анализ, а скорее дополняет его, заключается в определении гетерогенности популяций по экспрессируемым маркерам клеточной поверхности. В рамках этого второго подхода весьма популярными стали методы проточной цитометрии и сортировки клеток. [c.326]

Таблицы для оценки экспериментов с использованием метода лимитирующих разведений [c.358]

Независимо от того, как мало клеток в расчете на одну лунку используется в опытах по лимитирующему разведению, в некоторой доле лунок вырастают колонии, происходящие более [c.359]

АНАЛИЗ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ ЛИМИТИРУЮЩИХ РАЗВЕДЕНИЙ [c.249]

Активность надосадочной жидкости можно определить методом Лимитирующих разведений, добавляя ее в разных концентрациях. Обычно мы вносили надосадочную жидкость вторичной СКЛ в микрокультуры в конечной концентрации 50% <по объему). [c.254]

VI. ДАЛЬНЕЙШЕЕ РАЗВИТИЕ МЕТОДА ЛИМИТИРУЮЩИХ РАЗВЕДЕНИЙ [c.263]

К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора — проточного цитофлуори метра. [c.109]

Клонирование методом лимитирующих разведений. Этот метод является наиболее распространенным. Если клетки посеяны в 9б-луночные планшеты очень редко, то доля лунок, в которой наблюдается рост клеток, подчиняется распределению Пуассона (I. ЬеГкоуНг, Н. ШаИтапп, 1979) [c.109]

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

Быстрое развитие иммунологии нашло свое отражение в данной, третьей книге из серии Иммунологические методы , которая включает изложение экспериментального опыта, накопленного в Базельском институте иммунологии. В нее входят пять глав, посвященных применению рекомбинантных ДНК в иммунологии в двух главах описано использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения белков отдельные главы касаются следующих вопросов применение моноклональных антител для идентификации мембранных антигенов лимфоцитов, типирование антигенов гистосовместимости, новые методы анализа белков с помощью двумерного электрофореза, лимфокины, поддерживающие рост В-клеток. В четырех главах описано получение и ведение линий клонированных В- и Т-кле-ток и гибридом, а еще в четырех обсуждаются новые методы детектирования клеток, продуцирующих ревматоидный фактор. Две главы посвящены таким общим иммунологическим методам, как флуоресцентный сортинг клеток и анализ методом лимитирующих разведений, и наконец, четыре последние главы касаются сложных методов, используемых при работе с определенными видами животных (птицами, овцами и амфибиями) для изучения специальных иммунологических вопросов. [c.7]

Частоту встречаемости функционально активных В-клеток в пробах, отобранных из созревающих культур, определяют методом лимитирующих разведений (Lefkovits, Waldmann, [c.248]

Чувствительность методов, используемых для определения иммуноглобулинов (обнаружения антител), должна быть достаточной, для того чтобы можно было выявлять моноклональный продукт от одного активированного предшественника. Благодаря относительно большим размерам клонов В-клеток, образующихся под влиянием Т-хелперных клонов, большинство-обычных иммуноферментных методов оказываются достаточно чувствительными и к тому же очень удобными для проведения опытов с помощью лимитирующих разведений. Основные ссылки на применение иммуноферментных методов и приготовле- [c.272]

Частоту встречаемости В-клеток, активированных к выработке данного изотипа антител, можно определить с помощью метода лимитирующих разведений (МЛР) (см. обзор Lef ovits, Waldmann, 1979). Обычно культивируют различное число В-клеток (в том интервале, в котором это число лимитирует исследуемый ответ) в нескольких (24—60) параллельных опытах с постоянным числом Т-хелперных клеток и облученных клеток-стимуляторов. Тип системы с лимитирующим разведением и число культивируемых клеток зависят от частоты встречаемости исследуемых В-клеток. Культивирование можно проводить в лунках панелей Терасаки в объеме 20 мкл, содержащем 10 Т-клеток и 10 облученных МПК, используемых как стимуляторы число отвечающих В-клеток может варьировать от 1 до 100 на лунку. При более низкой частоте встречаемости отвечающих В-клеток культивирование можно проводить в лунках с V-образным дном 96-луночных панелей, содержащих по 10 Т-клеток и 5-10 МПК в 200 мкл RPMI — СПК на лунку число отвечающих В-клеток может варьировать от 1 до 10 на лунку, [c.276]

Таблица 16-1. Сравнение эффективности активации В-клеток аллореактивными клонами в массовой культуре и при использовании метода лимитирующих разведений

В-Клетки периферической крови стимулировали клетками аллореактивного клона ж 2 мл массовой культуры или в условиях лимитирующих разведений в луиках микропанелей Терасаки. В-Клетки идентифицировали окрашиванием поверхностного Ig. Клетки, содержащие цитоплазматический выявляли на 8-е сутки, используя стандартный метод иммунофлуоресценции на фиксированных препаратах. Общее содержание иммуноглобулина как в массовых культурах, так и прн использованин лимитирующих разведений определяли с помощью иммуноферментного анализа. [c.279]

Используя те же клетки, можно начинать культивирование с клонирования одиночных клеток или проводить анализ методом лимитирующего разведения. В ряде случаев популяцию предшественников В-клеток обогащают или даже выделяют их в чистом виде с помощью положительной селекции, применяя моноклональные антитела к антигенам В-220, АА4.1 или GF1.2. При этом используют методики адсорбции на чашках (пен-нинг), образования розеток или применяют флуоресцентный клеточный сортер. Одиночные клетки можно поместить с помощью микроманипуляций в круглодонные лунки микропанелей и культивировать их в 200 мкл WEHI-K или в присутствии очищенного ИЛ-3. При этом среду меняют каждые 3 ср и положительные культуры размножают в лунках панелей Limbro и во флаконах для тканевых культур. [c.310]

Эти клетки клонируют в полужидком агаре методом лимитирующего разведения или с помощью микроманипуляций. Мы предпочитаем микроманипуляции. 100 мкл WEHI-K помещают [c.311]

Тематика восемнадцати глав настоящего тома в известной мере отражает основные тенденции развития современной иммунологии. В семи главах в центре внимания находятся моноклональные антитела и антигены клеточной поверхности три главы посвящены использованию новейших достижений техники разделения биологических макромолекул и изучения поверхностных явлений в иммунологических взаимодействиях далее описаны новые, усовершенствованные варианты ряда известных экспериментальных подходов (методика гаптенизирова шых антител, выделение и клонирование Т-хелперов, определение хелперных факторов, обратный пассивный локальный гемолиз, метод лимитирующих разведений) в трех главах представлены новые методы клинической иммунологии (типирование HLA DR-антигенов, выявление антител к ДНК, оценка первичного иммунного ответа лимфоцитов человека in vitro). [c.5]

В наших опытах среды с добавлением надосадочной жидкости от вторичной СКЛ или культуры селезеночных клеток, активированных конкаиавалниом А, а также частично очищенного фактора роста Т-клеток, были одинаково эффективными при постппопко проб с лимитирующими разведениями ЦТЛ-П. [c.253]

Лимитирующее разведение суспензии клеток из лимфоузлов мышей С57ВЬ 6. I руппы из 24 микрокультур, в которых различные дозы указанных клеток кулы ивировали с 10 облученных клеток из селезенки мышей 0ВА/2 в течение 8 дней в присутствии 50%-ноА надосадочной жидкости из вторичной СКЛ. Определяли цитотоксическую активность лимфоцитов а каждой лунке но отношению К клеткам-мишеням Р815. меченных Сг. [c.258]

Основная проблема прн расчете частоты ЦТЛ-П по данным метода лимитирующих разведений — эго установление того, что можно считать отвечающей лункой. Получаемые данные удобно представлять в виде диаграмм зависимости числа импульсов Сг в отдельных луиках от дозы отвечающих клеток (рпс, 2). Из такого рода диаграмм видно, что нет четкой гра- [c.258]

Применение распределения Пуассона в связи с методом лимитирующих разведений подробно рассмотрено в других работах (Miller et ai., 1977 Lefkovits, Waldmann, 1979). В общей форме формула Пуассона дает вероятность F того, что данная культура содержит п ЦТЛ-П [c.260]

Мы описали применение метода лимитирующих разведений для изучения ответа ЦТЛ на суспензию клеток-мишеней одного типа. Одиако этот метод может быть использован и для других целей, напрнмер для определения специфичности ЦТЛ и их перекрестной реактивности с различными суспензиями клеток-мишеней, для оценки активности ЦТЛ при разных условиях, для сравнения частот пролиферирующих и цитотоксических клетОк-предшественпнков нли для определения взаимоотношений между генерацией активных ЦТЛ н клеток памяти. В этих случаях содержимое лунок после первичной СКЛ дробится на фракции для последующего раздельного анализа. [c.263]

Метод лимитирующих разведений можно также использовать для изучения взаимоотношений между ЦТЛ-П и клетками памяти в длительной СКЛ или для получения долгоживущих клоиов ЦТЛ (Teh et al , 1977, Ma Donald et al., 1980). Вкратце процедура опыта сводится к следующему. После первичной СКЛ культуру делят иа две части, одиу из которых используют для определения цитотоксической активности, а другую продолжают культивировать. Культуры можио поддерживать и размножать, повторно стимулируя облученными клеткам и добавлением ФРТК (см. первую книгу из этой серии, гл. 11), и затем при необходимости брать пробы для подсчета освобождения Сг, как описаио выше. [c.265]

Формула Пуассона описывает некоторое вероятностное распределение. В данном случае речь идет о вероятности того, что данная луика содержит ЦТЛ-П. Поэтому необходима методика, с помощью которой можио было бы четко отличить положительную (т. е. содержащую ЦТЛ-П) луику от отрицательной. Одиа из главных трудностей при использовании с этой целью метода лимитирующих разведений связана с тем, что такое различение в даииом случае невозможно. Распределение величии освобождения Сг при любой данной дозе отвечающих клеток часто бывает непрерывным и сдвигается вверх прн увеличении дозы отвечающих клеток (рис. 2). Для того чтобы данные были пригодными для анализа, необходимо решить, какая именно произвольно выбрак лая величина освобождения Сг будет Границей между положительным и отрицательным результатами, Эту величину обычно выбирают так, чтобы исключить из расчетов ложные положительные результаты, Одиако прн этом могут оказаться неучтенными истинно положительные ответы. Поэтому получаемые оценки числа ЦТЛ-П следует рассматривать как минимальные. [c.267]

В заключение следует отметить, что методом лимитирующих разведений для клонирования нужно пользоваться с осторожностью. Необходимо помнить, что отвечающие клетки распределены в культурах случайным образом, и даже ссли в среднем на луику приходится меньше одной клетки-предшествениика, в каких-то лунках может оказаться больше таких клеток. Из обшей формулы распределения Пуассона [уравнение (I)] можно [c.268]

Для клонирования с помощью лимитирующих разведений 33 клетки из колонии на мягком агаре вносят в 10 мл среды и затем разливают в лункн панели для микротитроваиия с QS плоскодонными лунками (№ 3396, ostar). В каждую лунку предварительно помещают облученные (3300 Р) клетки-стимуляторы (ЫОв) и 100 мкл 10% Ной надосадочной жидкости из культуры, стимулированной Кон-А. Культивирование проводят, как описано выше, и за ростом культуры следят с помощью-микроскопа. Нет необходимости в добавлении свежей среды. [c.310]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология