Клонирование эффективность

Необходимость в химическом синтезе нуклеотидной последовательности, кодирующей какой-то конкретный белок, может возникнуть тогда, когда клонирование соответствующего гена затруднено. При этом нуклеотидную последовательность гена находят из данных об аминокислотной последовательности белка. К химическому синтезу прибегают и тогда, когда кодоны, из которых состоит данный ген, плохо считываются организмом-хозяином, и уровень трансляции оказывается очень низким. В таком случае можно синтезировать ген с таким набором кодонов (оптимизация кодонов), при котором аминокислотная последовательность кодируемого белка остается прежней, а кодоны считываются хозяйским организмом более эффективно. [c.86]

Никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. Больщинство таких генов имеют уникальные молекулярные свойства, и оптимальные системы экспрессии для каждого из них приходится подбирать всякий раз заново. Эффективность экспрессии любого чужеродного гена зависит также от его родства с организмом-хозяином. Несмотря на то что многие представители как про- так эукариотических организмов способны [c.105]

Для эффективной экспрессии любого гена совершенно необходимо наличие сильного регулируемого промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе, поэтому прилегающие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) транскрибируются. Регулируемость промотора позволяет клетке (и исследователю) осуществлять строгий контроль транскрипции. Для экспрессии клонированных генов широко используется промотор хорошо изученного la (лактозного)-оперона Е. соН. Однако есть и другие промоторы, обладающие полезными для контроля экспрессии свойствами. Для их идентификации перед так называемым геном-репортером, кодирующим легко регистрируемый продукт, но лишенным [c.105]

Nm - второй по активности промотор в Е. соН и самый активный в других бактериях. Промо-торные участки у всех грамотрицательных бактерий имеют сходную нуклеотидную последовательность, однако это не означает, что самым эффективным промотором для того или иного организма будет тот, который наиболее эффективен в Е. соН. Тем не менее Е. со//-промоторы могут оказаться вполне приемлемыми для регуляции экспрессии клонированных генов и в других грамотрицательных бактериях. [c.111]

При наличии в клетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. При этом, как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем мал око-пийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции утрачивает плазмиды. Клетки, лишившиеся своих плазмид, обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились, и в конечном счете оказываются в культуре преобладающими. По прошествии нескольких генераций это отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Разработано по крайней мере два подхода к решению этой проблемы. В лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Однако добавление антибиотиков и каких-то других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные ферментеры приводит к значительному удорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены сохранялись, не утрачиваясь и не передаваясь другим микроорганизмам, в том случае, когда сконструированный микроорганизм предназначен для использования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазмидных генов. [c.123]

Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного количества чужеродного белка и нехваткой питательных веществ или строительных блоков — аминокислот, может произойти запуск стрессовых механизмов, в частности инициироваться синтез клеточных протеиназ, под действием которых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка. Истощение пула аминокислот может стать результатом эффективной экспрессии не только клонированных генов-мишеней, но и генов самого вектора, кодирующих маркеры устойчивости к антибиотикам. [c.128]

С помощью современных генетических методов биологи научились превращать бактерии в своеобразные биологические фабрики по производству белковых препаратов (например, рестрицирующих эндонуклеаз), различных химических соединений, аминокислот, антибиотиков и т. д. Клонируя в бактериальных клетках специфические гены, они создают новые пути биосинтеза для получения уникальных метаболитов, применяют клонированные гены болезнетворных микроорганизмов в качестве зондов для диагностики заболеваний человека и домашних животных, используют изолированные гены для получения безопасных и эффективных вакцин. [c.179]

Бактерии можно не только использовать как фабрики для синтеза белков типа рестриктаз, но и получать с их помощью новые продукты, изменяя метаболизм бактериальных клеток введением в них чужеродных генов или модификацией уже существующих. Можно создавать рекомбинантные микроорганизмы, способные синтезировать самые разные низкомолекулярные соединения Ь-аскорбиновую кислоту, краситель индиго, аминокислоты, антибиотики, мономерные единицы различных биополимеров. Общая стратегия при этом состоит во введении в организм хозяина специфических генов, клонированных в подходящем векторе, которые кодируют один или несколько ферментов, катализирующих не свойственные микроорганизму метаболические реакции или влияющих на осуществляемый им в норме биосинтез определенных соединений. По имеющимся данным, создание новых метаболических путей не является технически неосуществимым. Этот подход поможет создать необычные, более эффективные пути синтеза самых разных соединений. [c.272]

Под биомассой здесь понимается вся совокупность веществ и материалов, побочных продуктов пищевой и перерабатывающей промышленности, которая может служить сырьем для получения ценных продуктов. Производство этанола или фруктозы из молотого зерна происходит в несколько ферментативных стадий. Участвующие в этих процессах ферменты часто используются однократно. Чтобы повысить эффективность ферментативных реакций и снизить стоимость процессов, исследователи занимаются клонированием и исследованием свойств бактериальных генов, кодирующих термостабильные, обладающие высокой каталитической активностью и устойчивые к действию спирта ферменты. [c.302]

Для многих наследственных заболеваний никаких достаточно эффективных способов лечения не существует, и во многом это связано с трудностями получения и адресной доставки соответствующего генного продукта. После разработки методов идентификации и клонирования нормальных вариантов дефектных ге- [c.510]

Для достижения этих целей предстоит преодолеть определенные трудности в повышении эффективности генетической трансформации и, прежде всего, в идентификации и клонировании генов, создании их банков, расшифровке механизмов полигенной детерминации признаков и свойств биологических объектов, создании надежных векторных систем и обеспечении высокой устойчивой экспрессии генов. Уже сегодня во многих лабораториях мира с помощью методов генетической инженерии созданы принципиально новые трансгенные растения, животные и микроорганизмы, используемые в коммерческих целях. [c.16]

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий a l2 их мембрана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от общей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бактерий на 1 см поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. [c.121]

Весть о клонировании генов, осуществленном Коэном и Бойером, облетела весь мир. Многие исследователи немедленно оценили все преимущества этой стратегии и создали огромное количество методик, следуя которым, можно было с высокой эффективностью и относительно просто идентифицировать, выделять, охарактеризовы-вать и использовать гены. Эти технологические разработки внесли значительный вклад в развитие практически всех биологических дисциплин, включая науку о поведении животных, биологию развития, молекулярную эволюцию, клеточную биологию и генетику человека, однако наиболее глубокие изменения произошли в области биотехнологии. [c.16]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Рис. 6.1. Идентификация сильных регулируемых промоторов. В плазмиду встраивают ген-репортер без промотора. Хромосомную ДНК разрезают рестрицирующей эндонуклеазой Abel и встраивают фрагменты в плазмиду. Если ген-репортер эффективно экспрессируется, значит, клонированный фрагмент содержит функциональный промотор.

Эффективность инактивации белка-репрессора и соответственно активации транскрипции зависит от соотношения между числом молекул репрессора и числом копий промотора. Если концентрация репрессора слишком велика, то транскрипция не инициируется, и наоборот, если молекул репрессора очень мало (даже при том, что их больше, чем копий промотора), то транскрипция может идти и в отсутствие индукции. Про такие промоторы говорят, что они текут . Чтобы осуществлять строгий контроль таких регулируемых систем, разработаны разные стратегии. Например, ген репрессора и соответствующий промотор помешают в две разные плазмиды, присутствующие в клетке в разном числе копий это позволяет поддерживать нужное соотношение между числом молекул репрессора и числом копий промотора. Обычно ген репрессора находится в малокопийной плазмиде, число ее копий в клетке не превышает 8, а промотор - в мультикопийной плазмиде с 30-100 копиями на клетку. Ген репрессора может быть локализован и в хромосомной ДНК, находясь в ней в единственном числе, что позволяет поддерживать низкую концентрацию репрессора. В системах, использующих /ас-промотор, можно получить /ос-репрессор в значительно большем количестве, если заменить /ас/-ген его мутантной формой /дс/ч, что приводит к уменьшению протекания промотора, т. е. к снижению уровня транскрипции клонированного гена без индуктора. [c.108]

Культуры с такими двухплазмидными системами можно выращивать на недорогих средах на основе гидролизатов мелассы или казеина, содержащих незначительное количество свободного триптофана, и индуцировать экспрессию клонированного гена добавлением в среду трип-тона. Последний содержит свободный триптофан в количестве, достаточном для эффективной индукции транскрипции. Пробные испытания этой системы показали, что на долю продуктов клонированных генов (3-лактамазы и цитратсин- [c.110]

Наличие сильного регулируемого промотора -это очень важное, но недостаточное условие максимизации количества продукта клонированного гена. Большую роль играют также эффективность трансляции и стабильность самого продукта. В прокариотических клетках разные мРНК не всегда транслируются с одинаковой эффективностью. Различие может составить несколько сотен раз, и в результате в клетке будут присутствовать сотни или даже тысячи копий одних белковых молекул и лишь несколько копий других. [c.118]

Клонируемый ген встраивают в N ol-, Pst -или // иёШ-сайт, расположенный между сайтом связывания рибосомы и сайтами терминации транскрипции. Если его рамка считывания не попадает в ногу с кодоном AUG, то необходимо произвести минимальную коррекцию. В этом случае после индукции и транскрипции происходит достаточно эффективная трансляция клонированного гена. Однако следует иметь в виду, что поскольку нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевой участок белка-мищени, у разных клонированных генов неодинакова, нельзя создать универсальный вектор, исключающий одноцепочечное спаривание мРНК при любых обстоятельствах. Поэтому ни одна из областей инициации трансляции, как бы она ни была оптимизирована, не может га- [c.121]

Эффективной трансляции может препятствовать и несовместимость клеток, обусловленная тем, что в клонируемом гене имеются кодоны, редко встречающиеся в геноме организма-хозяина. В таких случаях в хозяйской клетке может не доставать транспортных РНК (тРНК), узнающих редко используемые кодоны, что снижает выход продукта клонированного гена. Как рещить эту проблему - не совсем понятно. Если продукт клонированного гена очень ценен, можно попытаться химически синтезировать такой вариант клонируемого гена, который состоит из кодонов, обычно используемых хозяйским организмом (оптимизация кодонов). [c.121]

Эффективность синтеза белка зависит от наличия в его мРНК специфических нуклеотидных последовательностей. Чтобы предотвратить разрушение белкового продукта или обеспечить его секрецию, клонированные гены, которые кодируют этот белок, подвергают направленным изменениям. Это может быть присоединение сайта связывания рибосомы перед сайтом инициации транскрипции (который в свою очередь тоже бывает нужно присоединить) или до- [c.130]

На первый взгляд разработка любой эукариотической системы экспрессии представляется относительно простой процедурой, состоящей в подборе соответствующих регуляторных последовательностей, встраивании их в вектор в определенном порядке и клонировании гена-мишени таким образом, чтобы обеспечивалась его эффективная экспрессия. На практике же создание первого поколения эукариотических экспрессирующих векторов оказалось весьма кропотливым делом, основанным на методе проб и ошибок. До появления работы Муллигана, Хоуарда и Берга [c.146]

Эти данные показывают, что несмотря на всю сложность прогнозирования результата специфических аминокислотных замен, с помощью описанного подхода все же можно идентифицировать боковые группы, замена которых приведет к улучшению кинетических свойств фермента. Кроме того, стало очевидно, что сродство данного фермента к субстрату, а также каталитическую эффективность реакции можно повысить in vitro, внося соответствующие изменения в клонированный ген. [c.172]

Самый простой способ использования природной способности Ti-плазмид к генетической трансформации растений предполагает встраивание интересующей исследователя нуклеотидной последовательности в Т-ДНК, а затем использование Ti-плазмид и А. tumefa iens для доставки и встраивания клонированного гена (генов) в геном компетентной растительной клетки. Однако, несмотря на то что Ti-плазми-ды являются эффективными природными векторами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для клонирования. [c.377]

Клонирование с помощью переноса ядра Плюрипотентность можно выявить, если перенести ядро тестируемой клетки в яйцеклетку с удаленным ядром и затем исследовать способность последней к развитию и образованию жизнеспособного потомства. В нескольких лабораториях с переменным успехом исследовали плюрипотентность линий эмбриональных клеток, клеток плода и взрослой особи. Было показано, что ядра эмбриональных клеток способны — хотя и с низкой эффективностью — обеспечивать развитие. Например, с помощью переноса ядер эмбриональных клеток крупного рогатого скота, культивированных непродолжительное время, были получены жизнеспособные особи. Всем известная овца по имени Долли была клонирована с помощью переноса ядра клетки мо- [c.426]

В 1980 г. исследовательские группы в Швейцарии и США выделили ген лейкоцитарного интерферона человека и ввели его в плазмиду Е. соН. В настоящее время предпринимаются усилия по промышленному получению интерферонов человека с помощью интерфероновых генов, клонированных в клетках Е, соН. Пока еще неясно, будут ли интерфероны эффективны при лечении рака, однако очевидно, что исследования в данной области откроют новую эру в понимании природы вирусных заболеваний человека. [c.990]

Процедура заключается в вьщелении нормального гена и его клонировании с использованием методов, которые обсуждались раньше в этой главе. Чтобы ввести ген в соответствующие клетки человека, понадобится безопасный и эффективный вектор. Клетки, по-видимому, нужно сначала вьщелить из организма, исправить, а затем вернуть на место. Это довольно просто сделать в случае болезней крови, таких как серповидноклеточная анемия, поскольку кроветворные клетки легко удалить из костного мозга и вернуть в организм. Самая важная проблема — убедиться в том, что исправленный ген нормально экспрессируется. Если такой ген не способен нормально включаться и выключаться, это может привести к более тяжелым проблемам, чем те, которые имеются, например, в случае образования слишком большого количества продукта. Ситуация оказывается еще более сложной, если болезнь вызвана доминантным геном. В этом случае доминантный ген также должен быть удален или инактивирован, а методы для этого пока не разработаны. [c.263]

Под действием электрического импульса происходит активация ооцита и слияние мембран между ядром клетки донора и энуклеированным ооци-том-реципиентом. Технология пересадки ядер клетки способствовала успешному получению клонированных живых кроликов, мышей, овец, коз, крупного рогатого скота и свиней. Было показано, что только эмбрионы на предимплантационной стадии являются тотипотентными, но эффективность этой технологии пока низка. У крупного рогатого скота была продемонстрирована следующая эффективность этой технологии на каждом этапе (%) энуклеация — 70—80, развитие морулы-бластоцисты клонированных эмбрионов — 20—30. В исследованиях K.P. Вондиоли (1991) 190 эмбрионов с пересаженными ядрами были получены из одного эмбриона путем многократной пересадки ядер из последовательно клонированных эмбрионов. Однако последовательные пересадки ядер после четвертого цикла сопровождались высокими эмбриональными потерями в матке. В итоге не удалось получить телят от пересадки эмбрионов, полученных после третьего цикла клонирования. [c.219]

При использовании в качестве доноров ядер более продвинутых в развитии эмбрионов крупного рогатого скота 6-дневного возраста (47-—68 бластомеров), по сравнению с использованием малоклеточных эмбрионов того же возраста (около 30 бластомеров), достигается более высокая эффективность слияния бластомера и ооцита, дробления эмбрионов и развития до стадии бластоцисты (В.И. Захарченко и др., 1996). Эффективность развития клонированных эмбрионов крупного рогатого скота выше при использовании в качестве источника бластомеров морул на стадии прекавитации. При этом свежевымытые морулы являются лучшими донорами ядер, чем развившиеся in vitro. [c.219]

Неутап et al. (1998) получили двух телят из клонированных эмбрионов с ядрами фибропластов, взятых на мышцы и кожи плода. Однако эффективность развития клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты была очень низкой (3— 8%). [c.220]

Создание разных типов траисгенных животных. Мечтой многих исследователей-селекционеров мира является разработка возможности не просто отбора животных с измененной хозяйственно-полезной изменчивостью, а преднамеренное изменение генотипа и направленное создание желаемого типа животных. Это оставалось мечтой до тех пор, пока не были сделаны выдающиеся открытия — выявление ДНК как носителя генетической информации, пока не были заложены основы рекомбинантной техники (открытие рестракционных энзим, клонирования ДНК и т. д.) или генной инженерии. В относительно короткие сроки были разработаны методы выделения из генома отдельных генов, создания эффективно функционируемых генных конструкций. В последующие годы были разработаны методы введения чужеродных генов в геном животных — реципиентов. Селекционеры получили в распоряжение могучий инструмент для создания животных с совершенно новыми свойствами. Что касается применения переноса генов у сельскохозяйственных животных, то надежды ученых в настоящее время связаны с улучшением продуктивности и качества животноводческой продукции, резистентности к болезням и создания так называемых генных форм или трансгенных животных-биореакторов ценных биологически активных веществ. [c.231]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонирование эффективность: [c.191] [c.122] [c.191] [c.98] [c.106] [c.111] [c.116] [c.120] [c.121] [c.124] [c.150] [c.337] [c.372] [c.387] [c.511] [c.176] [c.319] [c.322] [c.223] [c.226]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология