Процедура клонирования

Опишите процедуру клонирования целлюлазных генов грибов. [c.305]

Эффективность процедуры клонирования [c.51]

Цель картирования — облегчать процедуру клонирования известных генов и способствовать поиску в геноме интересующих клонов. Наличие карты позволяет легко соотносить друг с другом результаты разрозненных экспериментов по локализации в геноме различных клонов. [c.31]

Для этой процедуры клонирования необходимы следующие материалы [c.139]

Таблица 3.2. Процедура клонирования клеток в полужидком агаре

Чашки Петри диаметром 5 см для работ с клеточными культурами. Процедура клонирования описана в табл. 3.2. [c.140]

Чтобы быть уверенными, что данные клоны получены из одной клетки, а не из двух, целесообразно повторить описанную выше процедуру второй стадии метода лимитирующих разведений для каждой из трех отобранных колоний. Повторение процедуры клонирования единичных клеток имеет и то преим) ще-ство, что при проверке индивидуальных колоний, полученных после третьей стадии процедуры лимитирующих разведений, они все должны продуцировать антитела. Таким образом, гиб- [c.143]

Процедуры клонирования целевых фрагментов ДНК значительно упростились с развитием метода амплификации сегментов ДНК в полимеразной цепной реакции. [c.31]

Принцип методики ПЦР ясен из рис. 5-89, В. В каждом цикле реакции необходимо сначала кратковременное нагревание ДНК для разделения двух цепей двойной спирали (1-й этап) Последующее охлаждение ДНК в присутствии большого избытка двух упомянутых ДНК-олигонуклеотидов приводит к специфической гибридизации этих олигонуклеотидов с комплементарными последовательностями ДНК (2-й этап). После отжига смесь инкубируют с ДНК-полимеразой и четырьмя дезоксииуклеозидтрифосфатами, в результате чего избирательно синтезируются те участки ДНК, которые располагаются книзу от затравки (3-й этап). Для эффективной амплификации ДНК требуется от 20 до 30 циклов реакции В каждом последующем цикле количество ДНК по сравпепию с предыдущим циклом удваивается Отдельный цикл занимает около 5 мин, поэтому при автоматизации всей процедуры для бесклеточпого молекулярного клонирования какого-либо фрагмента ДНК требуется несколько часов, гогда как обычные процедуры клонирования растягиваются на несколько дней [c.341]

Аликвоты наращивают до стадии стационарной культуры каждая из них содержит независимые клоны провирусной ДНК, имеющей в своем составе ген neo. Описанная процедура клонирования требует использования компетентных бактерий, обеспечивающих высокую эффективность трансформации (по меньщей мере 2-10 мкг), в количествах, позволяющих получить 2-10 трансформантов. Однако высокоэффективная канамициновая селекция в жидкой среде делает отбор клонов относительно несложным. Подробно этот метод описали Браун и др. [12]. [c.301]

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

В дальнейшем процедура клонирования отдельных генов была упрощена. Выяснилось, что для их выделения из хромосомной ДНК на конце линеаризованного вектора достаточно иметь одну специфическую для гена последовательность, а на другом конце может располагаться повтор типа Alu (Kouprina et al., 1998). Рекомбинация происходит даже при длине концевых вставок, не превышающей 200 п.н. Такой подход, названный радиальным TAR-клонирование м, позволяет выделять гены с прилегающими к ним последовательностями неизвестного строения с целью их дальнейшего анализа. [c.361]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология