Клонирование под агаром

Таблица 3.2. Процедура клонирования клеток в полужидком агаре

Таблица 6.11. Клонирование в мягком агаре

Клонирование гибридом в полужидком агаре [c.312]

Клонирование при использовании в качестве векторов бактериофага А осуществляется следующим образом к суспензии бактерий, обработанных СаСЬ., добавляется ДНК фага и осуществляется посев на чашку Петри с питательным агаром так, чтобы на [c.435]

Рис. 21.11. Культура ткани. А. Растение первоцвета с хорошо развитыми листьями, которые можно разрезать на много мелких частей для клонирования. Б. Фрагменты листа перенесены на агар с соблюдением стерильности. В. Один из фрагментов листа, на котором образовался каллус и новый побег. Г. Побег отделили от фрагмента листа и поместили на достаточно толстый слой агара, чтобы стимулировать рост корней. Д. Молодые клоны перенесли в рыхлую культуральную среду, чтобы усилить развитие корней. Е. Идентичные растения, полученные из одного фрагмента листа путем клонирования.

Однако выявленные на этой стадии антитела необязательно являются моноклональными. Это обусловлено тем, что в ячейке, где культивируют клетки, может оказаться две и более гибридом, каждая из которых синтезирует свой тип антител. Поэтому следующим шагом после селекции является клонирование гибридом, целью которого является разделение клеток и наращивание отдельных клонов из одной клетки. Клонирование осуществляют двумя основными способами — в полужидком агаре и методом предельных разведений. [c.165]

Клонирование в мягком агаре [c.262]

Эффективность клонирования клеток в монослое, как правило, выше, чем в мягком агаре, поэтому этот метод часто используется при работе с линиями клеток. Нормальные и опухолевые клетки могут образовывать колонии в монослое, так что этот метод неприменим к биопсипному материалу опухолей, который обычно характеризуется высоким уровнем примесей клеток стромы. Метод клонирования в монослое биопсий опухолей [c.273]

Исследования выживаемости позволяют непосредственно изучать гибель размножающихся клеток путем определения эффективности клонирования в монослое или в мягком агаре. Конечные результаты, описанные в предыдущем разделе, могут быть использованы в качестве показателя репродуктивной целостности, если при испытании анализируется также и восстановительный период. Увеличение количества общего белка, числа клеток и белоксинтезирующей активности также может отражать способность к пролиферации. В этих случаях интерпретация более сложна, так как гетерогенная клеточная популяция по-разному реагирует на разные воздействия. [c.273]

II. эффективность клонирования дезагрегированных сфероидов в мягком агаре [c.274]

П. Эффективность клонирования в мягком агаре с использованием системы двойного агарового слоя. Приведенная процедура использует 1-часовой период обработки лекарством и требует четырех повторов на каждую экспериментальную точку. [c.282]

Если гибридомные клетки выращивали в панелях для культуры тканей с объемом лунок 2 мл (процедура гибридизации Б), а клонирование проводили в мягком агаре, как описано выше, то в некоторых случаях необходимо было проанализировать большое число колоний, прежде чем удалось обнаружить антителообразующую колонию. По этой причине клонирование проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для микротитрования с помощью последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода заключается в том, что образование антител единичными колониями, растущими в лун- [c.140]

КЛОНИРОВАНИЕ ОПУХОЛЕВЫХ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК В МЯГКОМ АГАРЕ. ВЫЯВЛЕНИЕ ГИБРИДНЫХ КЛОНОВ, ОБРАЗУЮЩИХ АНТИТЕЛА К БАРАНЬИМ ЭРИТРОЦИТАМ (БЭ) [c.407]

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий a l2 их мембрана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от общей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бактерий на 1 см поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. [c.121]

Процедура вьщеления ДНК в клетки дрожжей довольно проста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии СаС и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая ин( а-ция сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компонент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попадании в клетку-хозяина придают ей этот недостаюший признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать колонии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки подобно В. subtilis секретируют большое количество белка во внеклеточную среду, что используется также для секреции чужеродных белков, например интерферона человека (с. 43). [c.125]

Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 10 идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки Е. соИ, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашках Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейщее клонирование, нужно провести отбор трансформированных бактерий. [c.223]

С помощью техники клонирования, описанной в разд. 21.3, из одной трансформированной клетки можно получить целое растение. Для этого клетки сначала выращивают в жидкой культуре, затем образовавшуюся недифференцированную массу, называемую каллусом, помещают на питательный агар. При правильном соотношении гормонов формируются побеги, корни и вырастает новое растение. Другой способ получения трансформированных растений подразумевает использование Agroba terium. Диски, нарезанные из листьев, заражают бактерией и раскладывают на питательном агаре. В процессе роста трансформированные кпетки формируют корни и побеги. [c.230]

Для клонирования постоянных линий клеток применения этих методов, как правило, не требуется. Так, разведенная суспензия клеток HeLa (примерно 100 клеток в 5 мл) может быть использована для получения колоний, возникающих из единичных клеток. Важно лишь предотвратить передвижение этих клеток (приводящее к смешиванию клонов), для чего клетки иногда покрывают мягким агаром. [c.89]

К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора — проточного цитофлуори метра. [c.109]

Клонирование в полужидком агар-агаре. Для клонирования гибридом можно применять полужидкий агар (Р. offino и сотр., 1972). Обычно берется система, состоящая из двух слоев. Нижний (твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования. Ему дают затвердеть. Затем добавляют второй слой — мягкий, содержащий 0,3% агар-агара, в который включаются клонируемые клетки. При использовании клеток питающего слоя их засевают в чашку Петри до заливки агар-агара, и среду культивирования удаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя агара. [c.110]

Клонирование гибридов из — позитивных луиок в мягком агаре [c.177]

При клонировании по первому методу клетки высевают иа питательную среду с агаром. Из каждой клетки в течение 8—10 дней вырастают колонии, видимые под микроскопом. Колонии могут быть отобраны из агара пастеровской пипеткой и перенесены в жидкую питательную среду для микротитрования таким образом, чтобы одна клетка попадала в каждые 3—6 лунок. Клоны, синтезирующие антитела нужной специфичности, сначала переносят в лунки больших размеров, а затем наращивают в специальных флаконах для культивирования. Важной особенностью клонирования является то, что оно позволяет не только избавиться от клеток, потерявших способность синтезировать антитела, ио и позволяет отобрать клоны нужной специфичности со стабильными наследственными свойствами. Основным критерием моноклональности [c.165]

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

Ксеногенная иммунизация животных клонированными популяциями жизнеспособных клеток лимфомы приводит к активации и увеличению числа клеток, способных продуцировать антитела к чужеродным антигенам мышиных лимфом. С помощью соматической гибридизации получают иммортализованные антителосинтезирующие клоны и из них отбирают (тестируя антитела на способность связываться с клетками) только те, которые секретируют антитела против антигенных детерминант клеточных поверхностей. Культуры, которые содержат клетки, продуцирующие МА, клонируют в мягком агаре и подвергают повторному тестированию на способность связываться с клетками большого числа линий, представляющих различные стадии и направления дифференцировки. [c.176]

Методы культивирования в полужидкой среде основаны на ее высокой вязкости, что обеспечивает разъединенность внесенных в культуру клеток и, следовательно, дискретность развивающихся колоний. Растворимые компоненты легко диффундируют в полужидком носителе — матриксе и вследствие этого равномерно распределяются по всему объему культуры. Два главных преимущества клонирования клеток в полужидком агаре состоят в том, что с помощью этого метода легко проанализировать большое число клеток и легко визуализировать образующиеся клоны. Правда, недостаток всех методов клонального анализа — возможность случайного совмещения клонов, — разумеется, присущ и культивированию в полужидкой среде. Вероятные при этом ошибки оценивают в экспериментах по титрованию, которые позволяют установить порядок наблюдаемых событий. Для этого подбирают условия, при которых в ограниченном числе оказываются клетки только одного типа. Данные условия определяют по линейной зависимости между числом вносимых в культуру клеток и числом подсчитываемых событий (т. е. числом колоний). Таким образом были найдены условия как для роста sIg+В-клеток (Kin ade, 1981 а, Ь), так и для роста предшественников В-клеток (Paige, 1983, 1984 Paige et al., 1984). [c.255]

Для клонирования с помощью лимитирующих разведений 33 клетки из колонии на мягком агаре вносят в 10 мл среды и затем разливают в лункн панели для микротитроваиия с QS плоскодонными лунками (№ 3396, ostar). В каждую лунку предварительно помещают облученные (3300 Р) клетки-стимуляторы (ЫОв) и 100 мкл 10% Ной надосадочной жидкости из культуры, стимулированной Кон-А. Культивирование проводят, как описано выше, и за ростом культуры следят с помощью-микроскопа. Нет необходимости в добавлении свежей среды. [c.310]

Для клонирования клеток обычно используют среды, содержащие 0,3% агара (0,3%-ный раствор атара иногда называют мягким , а 0,5%-ный — твердым последний используют для приготовления нижних, или питательных, слоев, когда важно жестко иммобилизовать клетки. Однако при таких высоких концентрациях агара клеточный рост сильно подавляется. Добавляют 1 г агара (Бактоагар Dif o) к 100 мл дистиллированной воды и кипятят в колбе Эрленмейера. Этот раствор помещают в водяную баню при 43°С при такой температуре раствор агара не застывает. (Образование геля происходит при комнатной температуре. В таком виде его можио хранить. Перед использованием агар растапливают, поместив на кипящую водяную баню.) [c.392]

Клонирование клеток — их разделение путем рассева на питательном агаре и получение колоний, содержащих потомство от изолированной ютетки. [c.496]

Получить большие коллекции клонированных колоний или бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах не составляет труда. Бактерии и дрожжи хорошо растут на самом нитроцеллюлозном фильтре, помешенном на соответствуюший питательный агар (рис. 6.21). Фильтр, содержаший колонии, обрабатывают так, чтобы произошли лизис клеток и денатурация ДНК, отжигают денатурированную ДНК с зондом, идентифицируют бляшки, ДНК которых гибридизовалась, и отбирают клетки из соответствуюшего участка агара. Фаговые бляшки переносят на нитроцеллюлозный фильтр, наложив его на питательный агар (рис. 6.22). За один раз на фильтр может быть перенесено до 10000 бляшек с одной чашки диаметром 10 см. Если осторожно снять фильтр, то ДНК из каждой бляшки останется фиксированной на нем. После отжига и идентификации нужных бляшек можно отобрать фаговые частицы из бляшек, оставшихся на чашке с агаром. [c.293]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология