Гибридомы культивирование

Наиболее простым способом оценки специфичности моноклональных антител в процессе клонирования гибридом является метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением Т8Р-планшетов. ТЗР-планшеты представляют собой полисти-рольные стерильные крышки к 96-луночным культуральным платам, имеющие выступы, опускающиеся в лунки. Поверхность выступов ТЗР-планшетов может быть покрыта в стерильных условиях антигеном. Планшетом накрывают плату, в которой выращивают гибридомы таким образом, чтобы покрытые антигеном выступы опустились в среду культивирования гибридом. Выдерживают 1 ч и заменяют на новый планшет, выступы которого покрыты перекрестно реагирующим антигеном. Дальнейшую обработку ТЗР-крышек проводят в соответствии со стандартной методикой для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Используя этот метод, можно в течение одного дня провести оценку способности моноклональных антител взаимодействовать с перекрестно реагирующими антигенами. Это дает возможность уже через 12—15 дней отобрать и клонировать только те гибридомы, которые обладают нужной исследователю специфичностью. [c.172]

Второе направление развития Б. связано с клеточной инженерией. Культура растит, клеток может служить прежде всего источником свойственных данному растению вторичных продуктов, напр, антиаритмич. алкалоида ай-малина из раувольфин змеиной. Пользуясь способностью клеток растений превращаться на спец. средах в сформированное растение, клеточные культуры применяют для получения оезвирусных растений, пытаются проводить селекцию форм с нужными св-вами. Животные клетки более требовательны к условиям культивирования, им необходимы дорогостоящие среды. Все более широкое применение находят т. наз. гибридомы, полученные в лаборатории путем слияния двух различных клеток и служащие источником белков, необходимых для диагностики и лечения болезней человека, животных и растений. [c.290]

Выбор сыворотки. Отбору сыворотки необходимо уделять особое внимание. Сыворотки из различных источников сильно варьируют по свойствам. Надо проверять также каждую партию сывороток. Наибольшей способностью поддерживать рост гибридных клеток обладает сыворотка плода коровы (СПК). Чаще всего используют неинактивнрованную сыворотку, хотя некоторые исследователи предпочитают инактивировать ее прогреванием при 56°С в течение 30 мин для уменьшения возможной токсичности компонентов комплемента. СПК является одним из самых дорогих компонентов среды культивирования, поэтому с ней необходимо обращаться весьма экономно. Для культивирования клеток сразу после слияния, а также для клонирования используют высокую концентрацию СПК (15—20%). Как только гибридомы отобраны, их можно постепенно переводить иа рост в 10% СПК. Если клетки хорошо адаптировались, то концентрацию СПК можно снизить до 5%. [c.98]

Гибридомы, выращиваемые в сосудах для культивирования, синтезируют 5—10 мкг антител на 1 мл среды. При использовании специальных микроносителей типа Биосилон , выпускаемых фирмой Нунк, количество антител увеличивается до 100 мкг/мл. [c.166]

Многие линии клеток могут расти в суспензии в культуральных системах, используемых для культивирования клеток в монослое (т. е. без встряхивания или перемешивания). К числу клеточных линий, способных к такой форме роста, относятся многие линии лимфобластов (например, MOLT, RAJI), гибридомы и некоторые некроветворные клетки, такие как клетки LS, описанные в предыдущем разделе. Однако в последнем случае всегда существует опасность реверсии к монослою (небольшая часть линии клеток LS всегда прикрепляется к стенкам сосуда [c.96]

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

Для получения моноклональных антител, одиако, требуется не только большое число линий гибридом, ио и знание основных приемов поддержания этих линий в культуре, выявления аитител данной специфичности и их очистки. Поэтому в этой главе будут опнсаиы важнейшие вспомогательные методики, которые помогут исследователю, не имеющему опыта в культивировании клеток, вырастить и испытать гибридомы. Где это возможно, будут указаны нсточиики коммерческих реактивов. [c.314]

Одновременную инкубацию обоих конкурентов (меченого и немеченного миозина) с первичными антителами использовали Кларк и соавторы для отбора моноклональных гибридбм — продуцентов антител против миозина. Роль иммунной сыворотки в этих опытах каждый раз играли среды культивирования различных гибридом, полученных в результате слияния клеток селезенки крыс и мышей, иммунизированных миозином, и клеток миеломной линии P3-X63-Ag8. Инкубацию проводили в боратном буфере (pH 8,4), содержащем 40 мМ пирофосфата натрия, по 1% Тритона Х-100 и дезоксихолата, а также 2% нормальной сыворотки крысы или мыши. Эту сыворотку вводили опять-таки ради создания эквивалентного соотношения концентраций при последующем добавлении вторичных антител в составе анти сыворотки козы против иммуноглобулинов крысы или мыши Использовав для конкуренции миозин гомологичного и гетеро логичного происхождения, авторы выясняли степень специфич ности антител, синтезируемых гибридомами [ lark et al., 1980] [c.282]

Получение mAb. Ключевая идея, лежащая в основе получения mAb (Г. Колер и С. Мильштейн, 1975 г.), как и всё гениальное, очень проста сделать бессмертным В-лимфоцит, который исходно синтезирует антитела одного вида и специфичности, но сам по себе может совершать в культуре лишь ограниченное число делений в течение 10-14 дней культивирования. Практически это достигается путем слияния первичных В-лимфоцитов, секре-тирующих антитела, с опухолевыми миеломными клетками, которые данной способностью не обладают, но могут неограниченно долго делиться в культуре. В результате образуются гибридные клетки (гибридомы), которые приобретают от одной из исходных клеток способность продуцировать антитела требуемой специфичности, а от другой - способность к продолжительному росту и делению в культуре. Реализация данной схемы начинается с иммунизации экспериментальных животных, как правило мышей, антигенами, против которых предполагается получать антитела. Иммуногенами могут быть препараты очищенных макромолекул, их различные смеси, а также целые клетки или субклеточные структуры. После достижения антителами в сыворотке крови мышей необходимого титра селезенку иммунизированных животных используют в качестве источника В-клеток, продуцирующих искомые антитела. [c.404]

Выращенные таким образом в небольшом количестве культуры гибридных клеток проверяют на способность секретировать в питательную среду специфических антител и далее рассевают до отдельных клеток методом последовательных разведений. В результате, каждая клетка потенциально может стать родоначальницей клона, продуцирующего mAb требуемой специ-<4 ичности. Поскольку синтез антител в ряде случаев может быть токсичным для клетки-продуцента, вместо культивирования in vitro на этой стадии параллельно используют культивирование in vivo в виде асцитных опухолей у мышей. Отмечено, что непродолжительное культивирование in vivo в дальнейшем способствует стабилизации клеточных линий, продуцирующих mAb. Полученные таким образом, охарактеризованные клоны гибридом являются источником неограниченного количества mAb данной специфичности, которые можно получать, культивируя гибридомы в искусственной питательной среде или асцитной жидкости организма мышей. [c.405]

Для культивирования гибридом in vitro в основном используют два подхода. При одном из них гибридомы выращивают в течение 10 дней в виде суспензионных клеточных культур на искусственных питательных средах в присутствии фетальной телячьей сыворотки в качестве источника факторов роста. В ряде случаев гибридомы удается адаптировать к росту в бессыворо-точных средах. Концентрация mAb в таких средах к моменту завершения культивирования достигает 10 мг/мл. mAb можно сконцентрировать и очистить стандартными хроматографическими методами, включая аффинную хроматографию на колонках с иммобилизованными протеином А или протеином G, однако некоторые антитела не переносят таких манипуляций и денатурируют, утрачивая свою активность. [c.405]

В процессе фундаментальных исследований механизмов синтеза иммуноглобулинов, проводимых с применением клеточных культур и гибридологического анализа, выявились закономерности, практическое применение которых произвело революцию в иммунологии [1]. Был найден подход, позволяющий получать практически в неограниченных количествах моноклональные антитела (МонАТ) с известной специфичностью. Суть новой технологии состоит в получении гибридов между клетками миеломы и нормальными В-лимфоцитами от доноров, иммунизированных определенными антителами. В таких гибридах (гибридомах), которые при культивировании бессмертны , продуцируются гомогенные антитела против индивидуальных эпитопов антигена. [c.194]

Основными компонентами заменителей сыворотки являются транспортные белки, липиды, гормоны, агенты, стимулирующие секрецию антител, и др. Эти компоненты добавляются к среде определенного химического состава. В нашей лаборатории для культивирования гибридом применяется среда, предложенная Мураками и соавторами [11]. В качестве базовой среды используется смесь среды F-12 и DME (1 1). К ним добавляются инсулин (5 мкг/мл), трансферрин (35 мкг/мл), этаноламин (0.02 М), селенит (2.5 10 М), HEPES (15 10 М). На такой среде гибридомы поддерживаются in vitro в течение многих пассажей и сохраняют продукцию антител. [c.202]

Многие проблемы уже были упомянуты при описании отдельных этапов гибридомной технологии (подбор оптимальной среды, условий культивирования, тестирования и др.). Осложняет работу с гибридомами возможность инфекций. Поскольку в культуральную среду при получении и культивировании добавляют гентамицин (50 мкг/мл), то бактериальное заражение наблюдается чрезвычайно редко. Основную трудность представляет заражение плесневыми грибами, источником которого являются некоторые типы СОг-инкубаторов. Некоторые авторы используют противогрибковые антибиотики, например фунгизон. Однако они являются высокотоксичными. [c.204]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология