Слияние клеток полиэтиленгликолем

Слияние двух типов протопластов происходит при их смешивании в присутствии полиэтиленгликоля. Смесь наносят на стекло и через 15 мин отбирают продукты слияния. Затем их культивируют на питательной среде, в результате чего происходит регенерация клеточной стенки и образуется гибридная клетка, а затем соматический гибрид. [c.497]

Известно, что при смешивании клеток они могут спонтанно сливаться, однако событие это чрезвычайно редкое [1]. Эффективность слияния может быть существенно увеличена с помощью специфических антигенов. Первоначально для этой цели использовали инактивированный вирус Сендай [32], однако биологическая неоднородность различных партий инактивированного вируса и громоздкость процедуры слияния, индуцированного вирусом, привели к широкому использованию химического индуктора —полиэтиленгликоля (ПЭГ) [33]. Метод, представленный ниже, пригоден для слияния клеток как одного, так и разных видов животных. Внутривидовые гибриды формируются с частотой 10- —10- . Частота слияния клеток разных видов варьирует от 10 до 10 Клетки, имеющие сходные фенотипы и близкие параметры роста, сливаются с более высокой частотой. [c.13]

В результате слияния протопластов получение растений-регенерантов. При помощи ферментативного гидролиза разрушаются клеточные стенки и образуются раздетые клетки, или протопласты. Они способны к слиянию, и этот процесс называется парасексуальной гибридизацией растительных клеток. Индуктором слияния является полиэтиленгликоль, а образованные гибриды обрабатываются сильным щелочным раствором или диметилсульфоксидом. Техника слияния напоминает образование гибридов животными клетками, однако имеется существенное отличие. Слияние животных клеток позволяет получить только лишь новую клетку, а слияние протопластов является основой получения нового гибридного растения. Парасексуальная гибридизация посредством слияния протопластов дает возможность скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, а также комбинировать родительские гены растений в различных вариантах (рис. 31.3). [c.497]

Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломы-селезенки, миеломы-миело-мы, селезенки-селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы-селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки—селезенки вообще не растут в культуре, а миеломные клетки НОРЕТ и слившиеся клетки миеломы—миеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки [c.185]

На следующем этапе смешивают примерно 10 миеломных клеток с 10 клеток селезенки. Клетки в среде без сыворотки выдерживают 45 мин., центрифугируют в конических пробирках. Супернатант удаляют, осадок встряхивают и к нему добавляют 2 мл. 40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с ММ примерно 1,5—4,0 кДа, померживают температуру 37°С, pH среды 7,6—7,8, выдерживают 30 мин., затем в течение последних 7—8 мин. добавляют среду Дальбекко с фетальной телячьей сывороткой (5—15%). Клетки в разведенном ПЭГ осаждают, ресуспендируют в 30 мл. гибридомной среды с сывороткой и распределяют в лунки объемом 2 мл для микротитрования. При необходимости среду заменяют на свежую (среда с гипоксантином и тимидином). В среду добавляют клетки-фидеры, или "кормилки" (от англ. feeder — приток, питатель) — преимущественно перитонеальные макрофаги, индуцированные минеральными маслами) и 1% карбоксиметилцеллюлозу. В качестве индукторов слияния клеток можно использовать вирус Сендай, температурный шок, электроразряд и др. [c.574]

Лишь недавно этот метод генетической рекомбинации был испытан и на бактериях получали протопласты и затем индуцировали их слияние путем обработки полиэтиленгликолем. Из слившихся протопластов в определенных экспериментальных условиях регенерировали морфологически полноценные клетки, из которых получались стабильные рекомбинанты, обладавшие некоторыми признаками обоих родительских штаммов. Пока этот метод успешно применялся только в отношении грам-положительных бактерий, таких как Ba illus и Streptomy es. Следует ожидать, что в будущем он найдет более широкое применение. [c.471]

Две клетки, сливаясь, образуют гетерокарион - одну комбинированную клетку с двумя ядрами. Обычно, чтобы осуществить слияние клеток, клеточную суспензию обрабатывают инактивированными вирусами, или полиэтиленгликолем. Оба этих агента повреждают плазматическую мембрану клетки, что и приводит к слиянию клеток. Образование гетерокарионов дает возможность смешивать компоненты двух отдельных клеток с целью изучения их взаимодействия. Например, если неактивное ядро куриного эритроцита попадает в результате слияния в цитоплазму клетки, растущей в культуре ткани, то такое ядро реактивируется начинается синтез РНК, а затем и репликация ДНК. Именно в опытах по гибридизации клеток мыши и клеток человека впервые были получены данные, свидетельствующие о том, что белки поверхности клеток человека и мыши, находившиеся вначале на своих половинках гетерокариона, быстро диффундируют и перемешиваются по всей его поверхности [c.206]

ГОГО полового способа для введения в растение признака устойчивости к болезни. Однако сейчас стало возможным пара-сексуальное слияние культивируемых соматических клеток. Обычные растительные клетки не могут сливаться в культуре, так как их стенки препятствуют объединению протопластов. Однако с помощью смеси ферментов, разрушающих клеточные стенки, их можно растворить. Вначале для отделения одной клетки от другой используется пектиназа. Затем для разрушения стенок отдельных клеток применяют целлюлазу. Протопласты (содержимое живых клеток) можно затем собрать в иде осадка путем осторожного центрифугирования, обращаясь с ними как со свободноживущими микроорганизмами, лишенными оболочек (рис. 14.20). Если разрушение стенок производят в гипертоническом растворе, чтобы предотвратить разрыв протопластов, то изолированные ( голые ) протопласты остаются живыми. В соответствующих условиях у них может вновь образоваться стенка, они начинают делиться и затем регенерируют в целое растение. Если протопласты от двух разных видов растений смешать в присутствии индуцирующих слияние агентов, таких, как полиэтиленгликоль, то небольшая часть этих протопластов сольется друг с другом, образовав гетерокарионы (рис. 14.21), т. е. клетки, содержащие множество ядер от разных источников (рис. 14.22). При слиянии ядер могут образоваться настоящие парасексуальные гибриды. [c.436]

В 1975 г. Колер и Милстейн опубликовали сообщение о разработке гибридомно14 технологии для получения моноклональных антител, способных распознавать специфические, специально выбранные антигены. В первоначальном варианте для получения гибридом осуществляли слияние клеток селезенки иммунизированных мышей с линие11 миеломных клеток того же вида, используя вирус Сендай [1]. Потом в качестве агента, обеспечивающего слияние клеток, стали применять полиэтиленгликоль (ПЭГ) [2 ]. Далее было показано, что клетки селезенки могут быть иммунизированы in vitro за несколько дней до слияния, что позволяет преодолеть ряд потенциальных проблем, связанных с иммунной толерантностью и биологическим разрушением иммуногена [3]. Технические аспекты наиболее часто используемых методик детально описаны в работах [4-7 ]. [c.37]

Для стимуляции слияния липосом с клетками можно использовать либо белки вируса Сендай, либо полиэтиленгликоль. Белки вируса Сендай включаются в состав липосом в процессе реассоциации при этом слияние с клетками в определенных условиях происходит спонтанно (Vainstein et al., 1983). Можно также добавлять вирус Сендай во внешнюю среду. Содержащие фосфатидилэтаноламин липосомы имеют тенденцию к спонтанному слиянию с лимфоидными клетками ( orrea-Freire et al., 1984). [c.158]

Первые гибриды Е. oli-S. typhimurium и другие бактериальные межродовые и межвидовые гибриды получали традиционным генетическим методом — конъюгацией. Однако при этом обмен генами между клетками, относящимися к разным семействам, практически не происходит. Неограниченные возможности для объединения геномов, включая и геномы эволюционно далеких организмов, открывает техника слияния протопластов в присутствии полиэтиленгликоля. При межвидовой и межродовой гибридизации бактерий и дрожжей таким способом удается [c.438]

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) был впервые применен как сливающий гент к растительным клеткам [9]. Вскоре было показано, что поли-тиленгликоли с молекулярной массой 1000—6000 успешно сливают летки животных [10]. Главный недостаток ПЭГ — высокая токсич-ость. В связи с этим время контакта клеток с ним стараются ограни-ить 1 мин. Предложен способ слияния, заключающийся в мно-ократных очень коротких (по 1 с) обработках клеток 50 %-ным аствором ПЭГ с последующим переводом клеток в 25 %-ный аствор, затем в культуральную среду и снова в 50 %-ный раствор 1ЭГ [11]. Клетки, находящиеся на покровных стеклах, переносятся аким образом из 50 %-ного раствора ПЭГ в культуральную среду обратно 5—10 раз. В результате удается повысить частоту слияния леток в 3—5 раз и резко уменьшить токсический эффект ПЭГ [c.177]

Перспективным подходом к введению плазмидных ДНК в клетки млекопитающих стал разработанный В. Шаффнером в 1980 г. метод прямого переноса плазмид из бактерий в клетки животных. Метод основан на слиянии сферопластов клеток Е. oli с клетками животных. Для этого сферопласты осаждают на монослой клеток в искусственном поле тяжести (центрифугирование) при добавлении полиэтиленгликоля, который снижает отрицательный заряд на поверхности сферопластов и клеток и тем самым облегчает их слияние. Бактериальные клетки предварительно инкубируют с ингибитором белкового синтеза — хлорамфениколом. В этих условиях плазмиды с ослабленным контролем репликации амплифицируются и их копийность достигает нескольких тысяч на клетку. Повышенная копийность плазмиды обеспечивает высокую частоту ее проникновения в клетки животных. Другим достоинством данного метода является то, что для введения плазмид в клетки животных отпадает необходимость в наработке и очистке плазмидной ДНК. [c.337]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология