Бактерии центрифугирование в градиенте плотности

Синхронность культуры поддерживается в течение двух или трех циклов деления клеток в случае более длительного периода синхронность приходится устанавливать заново с помощью описанного выше метода. Проточное зональное центрифугирование в градиенте плотности позволяет получать большие количества инокулята для синхронизованного культивирования микроорганизмов. Оно представляется перспективным в обеспечении непрерывной синхронизации с помощью рассчитанной во времени инокуляции турбидиметрически регулируемой проточной культуры (турбидостат). На рис. 10.8 показана типичная кривая роста синхронизованной популяции бактерий видно, что после двух циклов кривая начинает выравниваться. [c.417]

Потенциально фоточувствительные вирусы, такие, как миксовирусы, нужно защищать от света. Что касается рН-стабильности, то вирусы обычно наиболее стабильны от слабощелочных значений pH до их изоэлектрических точек. Для большинства вирусов наиболее оптимальны значения pH 6,7—7,6, Следует также избегать образования пены и гидродинамических воздействий, особенно в случае высокоочищенных препаратов вирусов. При длительных процедурах очистки, таких, как электрофорез и равновесное центрифугирование в градиенте плотности солей тяжелых металлов, необходимо к вирусной суспензии добавлять стабилизирующие коллоиды. Обычно добавляют очищенный альбумин сыворотки крови до концентрации 0,02% [272, 520] иди обезжиренную и лишенную комплемента сыворотку крови в концентрации 0,2% [268]. Также нужно избегать неблагоприятной концентрации ионов в окружающей вирус среде. Чтобы не произошла преципитация вируса, буферный раствор должен иметь значение pH, достаточно отличающееся от его изоэлектрической точки. На первых стадиях очистки нужно использовать буферы очень слабой ионной силы. Например, 0,01 М фосфатный буфер и 0,01 М цистеин при pH 7,0 более выгоден, чем буферы с высокой ионной силой. При работе с лабильными вирусами (вирус саркомы Рауса) хорошие результаты дает применение 0,02 М цитратного натриевого буфера (pH 6,7). В процессе очистки должна быть совершенно исключена бактериальная и грибковая контаминация при помощи тщательной стерильной обработки Это особенно важно, когда процесс концентрирования и очистки контролируется биологическим титрованием. Между отдельными стадиями очистки рост бактерий можно задержать снижением температуры, добавлением антибиотиков (100— 200 Ед/мл) или органических растворителей, например хлороформа в низких концентрациях. [c.30]

Если можно получить радиоактивно меченые молекулы белков, как, например, в случае бактерий, то для изучения четвертичной структуры можно использовать метод гибридизации. При денатурации, приводящей к обратимой диссоциации белковых молекул на субъединицы, можно получить гибриды тяжелых и легких молекул и разделить затем эти гибриды центрифугированием в градиенте плотности. Число субъединиц, появляющихся при денатурации, можно установить непосредственно по различиям плотностей гибридных тяжелых и легких молекул. [c.402]

А. Плотность тяжелых и легких бактериальных рибосом. Клетки . соЦ, выращенные на меченной N , С Р -среде, смешивают с 50-кратным избытком клеток, выращенных на обычном питательном бульоне. Из этой смешанной популяции бактерий рибосомы экстрагируют, растирая клетки с окисью алюминия, а затем очищают дифференциальным центрифугированием. Затем рибосомы центрифугируют в градиенте плотности хлористого цезия. Каждый вид рибосом дает два максимума — а и Ь. Максимум Ь радиоактивности меченых, тяжелых рибосом находится непосредственно под максимумом а поглощения немеченых, легких рибосом. [c.392]

Если, например, вырастить культуру одной из бактерий на тяжелой воде (D2O), то у нее будет тяжелая ДНК, и тогда образование гетеродуплекса можно будет выявить путем центрифугирования в градиенте плотности s l-так же, как в опыте Меселсона и Сталя было доказано образование N/ N-rH6pHfl-ной ДНК. Можно, однако, пометить ДНК одного из партнеров, выращивая его на среде с С или с Если теперь смешать длинные отрезки денатурированной ДНК (из непомеченной С бактерии А) с короткими отрезками денатурированной ДНК (из помеченной С бактерии В), медленно охладить смесь и провести ее через фильтр, задерживающий длинные цепи, но пропускающий короткие, то на фильтре останутся молекулы гетеродуплекса. Оставшаяся на фильтре радиоактивность будет тем выше, чем больше радиоактивных отрезков (В) связалось с А-депями, т.е. она будет зависеть от того, идентичны ли (либо очень сходны) последовательности оснований ДНК А и В или же они совсем различны. Таким образом, реассоциация ДНК/ДНК дает возможность определять степень гомологии последовательностей ДНК разного происхождения. Контрольный опыт проводят с молекулами ДНК из одних и тех же бактерий (одну пробу метят, другую не метят) и произвольно принимают степень реассоциации за 100. Степень реассоциации молекул ДНК из различных штаммов выражают затем в процентах от этой величины. Рутинные методы определения гомологии между ДНК различных штаммов бактерий многократно видоизменялись, но все они основаны на том же принципе образования гетеродуплексов во всех случаях необходимо пометить одного из партнеров. [c.41]

Культуру бактерий Е. соИ вырастили в течение длительного времени на среде, содержащей азот Затем клетки перенесли на среду с где они находились в течение одной генерации. После этого клетки вновь поместили на среду с N, на время, соответствующее одной генерации. Затем из бактерий выделили ДНК, подвергли центрифугированию в градиенте плотности s l и проанализировали распределение радиоактивной метки (рис. 15). Какую картину можно увидегь при анализе полученного препарата [c.30]

Б ДНК но мере размножения бактерий с интервалом в несколько поколений. Каждую пробу обрабатывали додецилсульфатом натрия и центрифугировали в градиенте плотности Gs l нри 140 ООО g в течение 20 час, чтобы дать возможность ДНК достичь седиментационного равновесия. Полосы ДНК были обнаружены в градиенте хлористого цезия при плотности 1,71 г1см они хорошо отделились от всех остальных макромолекулярных компонентов бактериального лизата. Положение полос ДНК определялось в ходе центрифугирования по поглош ению в ультрафиолете. [c.196]

Первый эксперимент с применением метода центрифугирования в градиенте плотности [461] особенно наглядно продемонстрировал значение этого метода. В этом эксперименте бактерии выращивались на среде, богатой № , и поэтому дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) организмов, меченных изотопом тяжелого азота, обладала несколько большей плотностью, чем обычная ДНК. Через определенное время бактерии переносили в среду с обычным распределением изотопа азота и методом центрифугирования в градиенте плотности анализировали изменения плотности ДНК, выделенной из ряда последовательных генераций клеток. На основе предположения Уотсона и Крика [30] было принято, что редупликация ДНК во время деления клеток включает разделение двух цепей двойной спирали (см. стр. 130), причем каждая цепь служит матрицей для синтеза дополняющей ее цепи. Если этот механизм достоверен, то вторая генерация клеток, происходящих от клеток, меченных N , должна содержать ДНК, в которой изотопом тяжелого азота мечена одна из цепей каждой двойной спирали. В последующих генерациях должно возрастать количество ДНК с обычным распределением изотопов азота, однако при этом сохраняется также некоторое количество наполовину меченной ДНК. В любой данный момент времени в растворе должны присутствовать молекулы ДНК только с тремя четко определенными плотностями и никаких компонентов с промежуточной плотностью обнаруживаться не должно. Это предположение было полностью подтверждено данными по ультрацентрифугированию в градиенте плотности (рис. 55), и поэтому механизм редупликации ДНК, который раньше был лишь плодом смелых теоретических представлений, можно считать в настоящее время окончательно установленным. В относительно короткое время после этого классического эксперимента метод центрифугирования в градиенте плотности различными путями способствовал развитию биохимических исследований. Можно привести несколько примеров, иллюстрирующих это положение. Методом меченых атомов, подобным описанному выше, было установлено, что некоторая часть рибонуклеиновой кислоты (РНК) переходит в последующие генерации клеток в нативной форме [468]. Было найдено, что плотность ДНК является линейной функцией содержания гуанина и цитозина в различных микроорганизмах, и, таким образом, ДНК, выделенная из какого-либо вещества, образует в градиенте плотности полосу с характерным расположением [469, 470]. На диаграмме градиента плотности ДНК, полученной из тканей высших организмов, периодически обнаруживаются сателлит-ные полосы [471], которые могут быть обусловлены симбиозными организмами или другими, еще неизвестными причинами. Типичный пример этого эффекта изображен на рис. 56, который, между прочим, наглядно свидетельствует также о чувствительности метода обнаружения малых [c.165]

Одна часть раствора гибридной ДНК, выделенной из меченных 15N бактерий Е. oli, выращиваемых в течение одной генерации в среде, содержащей N, денатурирована таким образом, чтобы произошло разделение двух комплементарных полинуклеотидных нитей. ДИК-свидетель, выделенная из культуры пневмококков, была добавлена как к неденатурированной (Л), так и к денатурированной (Б) гибридной ДНК . соН. Оба образца ДНК исследовали центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. На оси ординат показано поглощение ультрафиолетовых лучей и, следовательно, концентрация ДНК в градиенте плотности. [c.197]

Как ясно видно из фиг. 177, плотность трансдуцирующих и инфекционных частиц, образовавшихся в равномерно меченной тимином легкой культуре А, не в точности совпадает и, следовательно, эти частицы можно разделить по плотности с помощью метода градиентного центрифугирования в s l. Таким образом, можно определить, какая доля частиц фага Р1 в лизате обладает трансдуцирующей активностью. Для этого ДНК бактерий-доноров метили Н, выращивая культуру на среде с Н-тими-дином. Затем культуру переносили на среду с нерадиоактивным тимиди-ном и Ф0 , так что ДНК, синтезированная после этого переноса, содержала метку Наконец, культуру заражали фагом Р1 и образовавшийся фаголизат фракционировали центрифугированием в градиенте плотности s l. Эти опыты показали, что количество меченной Н ДНК во фракции частиц, способных осуществлять трансдукцию маркера Leu+ донора, составляет 0,3% общего количества меченной Р ДНК, входящей в состав всех фаговых частиц, подвергнутых фракционированию. Следо- [c.356]

Замещение иссеченных нуклеотидов, окружающих тиминовый димер, происходит за счет репарационной репликации. За этим процессом можно проследить, поставив опыт по распределению вещества при репликации (фиг. 97) с облученными ультрафиолетом клетками Е. соН Thy . Для этого культуру облученных ультрафиолетом бактерий выдерживают разное время в присутствии меченного радиоактивным атомом бромурацила (БУ). При этом на место тимина в реплицирующуюся ДНК происходит включение более плотного БУ. Затем для измерения плотности молекул ДНК, включивших радиоактивный БУ, выделенную из бактерий ДНК подвергают равновесному центрифугированию в градиенте плотности s l. Оказалось, что бромурацил обнаруживается лишь в тех молекулах ДНК, плотность которых не отличается от плотности обычной легкой ДНК. Таким образом, в отличие от обычной репликации, которая, как это показано в гл. IX, происходит только в одной репликационной Y-вилке, репарационная репликация происходит во многих различных точках генома. Действительно, в этом случае БУ явно включился в большое число коротких полинуклеотидных сегментов, окруженных длинными участками неренлицировавшихся полинуклеотидных ценей, так что небольшое количество отдельных остатков БУ не оказывает какого-либо заметного влияния на плотность ДНК. [c.375]

Центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия риоосом нормальных и зараженных фагом бактерий, а также постинфекционной РНК, синтез которой индуцируется фагом. Светлые кружки — оптическая плотность при 254 нм (т. е. общее содержание нуклеиновой кислоты), темные кружки — радиоактивность (т. е. содержание меченой РНК) в каплях, собранных через отвсрстне [c.392]

Возможность использования ДНК фага ptA—Е в качестве специфического детектора /г/ -мРНК позволяет также прямо проверить точку зрения, выдвинутую в гл. XVI, что молекулы мРНК представляют собой полигенные матрицы, содержащие последовательность нуклеотидов нескольких соседних генов. С этой целью меченная Н РНК, выделенная из дерепрессированных бактерий, была подвергнута центрифугированию в градиенте плотности сахарозы. РНК, содержащуюся в разных фракциях этого градиента, гибридизовали с ДНК фага ptA—Е для того, чтобы выяснить положение радиоактивной /гр-мРНК в градиенте и, следовательно, рассчитать скорость ее седиментации. [c.490]

У обоих фагов Одна цепь ДНК отличается от другой по плавучей плотности. Благодаря этому после плавления ДНК этих бактериофагов тяжелую и легкую цепи можно разделить при помощи центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Если теперь взять только тяжелые цепи ДНК, то благодаря тому, что Za -оперон был включен в геномы Я и ф 80 в противоположных ориентациях, лишь один участок этих цепей будет иметь комплементарные последовательности оснований. Это участок ДНК /ас-оперона. Тогда при гибридизации тяжелых цепей получается совершенный дуплекс только на участке Za -оперона, а остальные части цепочек останутся неспаренными (рис. 11.6, А). Их удаляли действием нуклеазы, специфичной к однонитевой ДНК, и таким образом получили ДНК генов лактозного участка Е. соИ в чистом виде (рис. 11.6, ). Эксперимент Дж. Беквита и других принято считать началом генной инженерии. Поскольку подход к выделению /ас-оперона весьма специфичен для бактерии Е. соН, его сменили другие приемы, применимые в работе с любыми организмами. [c.268]

Компетентные клетки составляют не более 5-10 % всей популяции бактерий. Они отличаются от некомпетентных клеток по составу клеточной стенки, имеют сниженный поверхностный заряд и повышенную чувствительность к осмотическому шоку. Последнее, по-видимому, обусловлено тем, что у компетентных клеток имеются участки обнаженной плазматической мембраны. Предполагают, что именно с ними и взаимодействует трансформирующая ДНК. Компетентные клетки характеризуются пониженной метаболической активностью и меньшими размерами по сравнению с обычными клетками. Различие в размерах позволило выделить фракции компетентных клеток из культуры В. subtilis зональным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы или ре-нографина и доказать, что экзогенная Д1Ж проникает только в компетентные клетки. [c.235]

Фотосистемы I и II различаются по своей структуре. При обработке мембран тилакоидов детергентами освобождаются преимущественно частицы, содержащие фотосистему I. Методом центрифугирования в градиенте плотности можно разделить частицы, обладающие только активностью фотосистемы I, и частицы, обогащенные активностью фотосистемы II. Большинство молекул хлорофилла связано со специфическими белками. Из частиц, содержащих фотосистему I, выделен комплекс, состоящий из 14 молекул хлорофилла а, связанных с белком 110 кДа. Второй вид комплекса, образованный частицами фотосистемы II, содержит 3 молекулы хлорофилла а и 3 молекулы хлорофилла Ь, связанные с белком 28 кДа. Наиболее хорошо охарактеризованный хлорофилл-белковый комплекс, выделенный из зеленых бактерий, состоит из трех субъединиц 50 кДа, каждая из которых содержит семь молекул бактериохлорофил-ла (рис. 19.11). Одна из функций белка в этих комплексах заключается в поддержании оптимальной геометрии для переноса энергии между хлорофиллами. [c.188]

Бактерии выращивали в среде, содержав-щей тяжелые изотопы ( N и С), заражали фагом и немедленно переносили в среду, содержащую легкие изотопы ( К и С). Рибосомы, синтезированные до и после з ижения, можно было разделить центрифугированием в градиенте плотности, так как их гглотности различались ( тяжелые и легкие соответственно рис. 25.4). Новая РНК бьша помечена радиоактивными изотопами с помощью Р-и с-урацила, а новый белок был помечен изотопом S. В результате этих экспериментов было установлено следующее. [c.49]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология