ДНК-полимераза полимеразной цепной реакции

Рис. 5-89. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), используемая для амплификации специфических нуклеотидных последовательностей in vitro А Выделенную из клеток ДНК нагревают, чтобы разделить ее комплементарные цепи. Затем проводят отжиг этих цепей, добавив к ним избыток двух ДНК-олигонуклеотидов (по 15-20 нуклеотидов каждый), синтезированных химически с таким расчетом, чтобы они были комплементарны последовательностям, отделенным друг от друга расстоянием в X нуклеотидов (значение X варьирует от 50 до 2000). Эти два олигонуклеотида служат специфическими затравками для синтеза ДНК in vitro, катализируемого ДНК-полимеразой, которая копирует ДНК между соответствующими последовательностями. Б. Многократное повторение циклов реакции дает в итоге большое количество копий одного фрагмента

Использование специфических термостабильных ДНК-полиме-раз — Tth- и Taq-полимераз — выделенных из бактерий, живущих в гейзерах, позволило проводить амплификацию — множественную наработку любого фрагмента ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР, в основу которого положена Г(яд -полимераза, не только упростил некоторые старые методики генной инженерии, но и позволил проводить молекулярное маркирование как отдельных генов, так и целых геномов. [c.24]

США Муллис К. Открытие метода полимеразной цепной реакции для получения новьк молекул ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы [c.543]

Доступность очищенных ДНК-полимераз и химически синтезированпых ДНК-олигоиуклеотидов сделала возможным быстрое клонирование специфических последовательностей ДНК вне живой клетки. Методика, известная под названием полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет амплифицировать ДНК из какого-нибудь выбранного участка генома более чем в миллион раз, при условии, что нам известна хотя бы часть его нуклеотидной последовательности. Участки этой последовательности, окружающие выбранную для амплификации область, используют для того, чтобы приготовить по ним два синтетических ДНК-олигонуклеотида, каждый из которых комплементарен одной из двух цепей молекулы ДНК. Эти олигонуклеотиды служат затравками при синтезе ДНК in vitro катализируемом ДНК-полимеразой опи определяют концы получаемого фрагмента ДНК (рис. 5-89, AJ. [c.341]

Хотелось бы подчеркнуть, что научная работа Л.И. Патрушева не ограничивается теоретическими изысканиями и литературной деятельностью. Эту сторону научной работы ему удается плодотворно совмещать с экспериментальными исследованиями генетических явлений. Вместе со своими сотрудниками автор монографии внес заметный вклад в биотехнологию, получив одним из первых в России высокопродуктивный бактериальный штамм-продуцент термостабильной ДНК-полимеразы Ткегтиз адиа1киз и разработав эффективные методы ее очистки. В настоящее время этот фермент находит широкое применение во многих лабораториях у нас в стране и за рубежом. Являясь членом Международного общества по исследованию тромбозов и гемостаза (18ТН), Л.И. Патрушев разработал универсальную систему ал-лель-специфической ПЦР, которая, в частности, позволяет диагностировать мутации, ассоциированные с тромбофилиями, и с ее помощью впервые осуществил анализ генетической структуры российской популяции в отношении распространенности данных генетических маркеров. В этом направлении на стыке генетики и медицины он продолжает активно работать и в настоящее время. То, что Л.И. Патрушев знает о генетических методах не понаслышке, придает его книге особую ценность, так как читатель может найти в ней много советов и рекомендаций (см., например, раздел о полимеразной цепной реакции в первой части книги), которые могут оказать практическую помощь при проведении его собственных исследований. [c.7]

Вся полимеразная цепная реакция осуществляется in vitro с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотид ных праймеров, комплементарных двум З -концам участков, офаничивающих ампли-фицируемый дуплексный сегмент. Таким образом, разработка НЦР-метода стала возможной лишь после того, как были созданы методы быстрого и недорогого химического синтеза олигонуклеотидов (разд. 6.1.в). Для осугцествления реакции необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка, который мы хотим амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры. При творческом применении НЦР-метода он существенно дополняет методы молекулярной генетики, и если бы часть II книги не была фактически завершена до того, как этот метод был окончательно разработан, его основы были бы обязательно изложены в гл. 5-7. [c.360]

Широкое распространение в генно-инженерной практике получили термостабильные ДНХ-полимеразы. Они незаменимы в опытах с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР, см. приложение), а также для секвенирования ДНК методом высокотемпературного полимеразного копирования и с применением термоциклеров (см. гл. 9). [c.176]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет за небольшое время увеличить количество специфической последовательности ДНК в миллионы раз (Ми1И5, Ра1оога, 1987). Для ее осуществления необходимо иметь два праймера, фланкирующих эту последовательность и ориентированных в направлении 5 ->3 в ее сторону. Таким образом, праймеры гиб-ридизуются с противоположными нитями ДНК, и при добавлении ДНК-полимеразы синтез ДНК идет на обеих нитях между праймерами. [c.467]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод получения большого числа копий гена или его фрагмента в условиях репликации in vitro, требующий очень малых количеств исходной ДНК в образце. Реакционная смесь для получения интересующей нас ДНК содержит исследуемую ДНК, субстраты реакции — 4 dNTP, 2 праймера, термостабильную, или Tag-полимеразу, и буфер, содержащий ионы Mg. [c.91]

Полимеразная цепная реакция была открыта в 1984 г. К.Б. Мюллисом. Она основана на том, что новосинтезируе-мые цепи нуклеиновых кислот могут служить матрицами в следующих циклах репликации. Реакция осуществляется последовательными циклами. Каждый из них начинается с разделения двуспиральной молекулы ДНК на две одноцепочечные. В таком состоянии каждая цепочка может служить матрицей для репликации. Затем одноцепочечные нити ДНК инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы в растворе со смесью всех четырех нуклеотидов и специфической последовательностью ДНК — праймером. Присоединение праймера к одноцепочеч-ной нити ДНК приводит к образованию небольшого двуцепочечного отрезка, который удлиняется с по.мощью ДНК-полимеразы. Процедуры многократно гювторяются, происходит. множественное копирование старых и новых одноцепочечных молекул. Отдельный цикл занимает около 5 мин., клонирование одного фрагмента ДНК происходит всего в течение нескольких часов. [c.71]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая амплифицировать специфический сегмент ДНК. Два олигонуклеотидных праймера, по одному для каждой цепи, ограничивают амплифицируемый сегмент. Вначале ДНК денатурируют, затем производят отжиг праймеров, после чего ДНК-полимераза катализирует удлинение цепи в присутствии четырех нуклеозидтрифосфатов (цикл 1). Второй и последующие циклы запускают повышением температуры, вызывая денатурацию дуплексных молекул. В каждом цикле количество нужного сегмента удваивается. После нескольких циклов в смеси преобладают дуплексы, соответствующие нужному сегменту (короткие молекулы ДНК). Реакция идет эффективно, если размер амплифицируемого сегмента не превышает 2 т.п.н. [c.363]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология