Олигонуклеотиды химический синтез

С разработкой быстрых и недорогих методов химического синтеза фрагментов ДНК методология молекулярно-биологических исследований ДНК существенно изменилась. Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать для конструирования целых генов или их фрагментов, для амплификации специфических фрагментов ДНК, для направленных мутаций изолированных ДНК, а также в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. [c.47]

Рис. 5.1. Химический синтез олигонуклеотида. После п циклов образуется одноцепочечный фрагмент ДНК из я -Ь 1 нуклеотида.

Химический синтез олигонуклеотидов [c.354]

Хроматографические методы, позволившие разделить продукты химического или ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот, сделали возможным в последние годы объяснение строения последних [14, 15, 44, 91]. Эти методы служат также для анализа мононуклеотидов [91, 92], олигонуклеотидов и смесей полинуклеотидов, получающихся при химическом синтезе [36, 44, 45, 90] или под действием ферментов [50, 65, 66). [c.451]

Химический синтез нуклеиновых кислот (в биологическом смысле этого слова) пока еще не осуществлен, однако в конечном счете это будет достигнуто при условии, что будет определена точная структура природных полимеров. Методы полимеризации мононуклеотидов оказались уже сейчас пригодными для синтеза олигонуклеотидов и низших полинуклеотидов при контроле последовательности нуклеотидов. [c.467]

Химический синтез палиндромных двухцепочечных олигонуклеотидов, получивших наименование линкеры (связывающие звенья) дает возможность клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к специфичности сайтов рестрикции. Эти короткие тупоконечные (т.е. не обладающие одноцепочечными концами) молекулы двухцепочечной ДНК могут ДНК-лигазой фага Т4 ковалентно соединяться с произвольными тупоконечными фрагментами ДНК, которые мы хотим клонировать (рис. 9,13), Эти фрагменты могут выстригать- [c.279]

В последние годы достигнут значительный прогресс в автоматизации и ускорении синтеза олигонуклеотидов, тем не менее химический синтез гена — большой трудоемкий процесс. Другое ограничение этого метода связано с необходимостью точно знать первичную структуру белка, что не всегда доступно. [c.98]

Химический синтез олигонуклеотидов, соответствующих обеим целевым нитям. Олигонуклеотиды должны содержать свободные концевые 3 - и 5 -гидроксильные группы. Фрагменты, принадлежащие к противоположным цепям, должны перекрываться. [c.60]

Химический синтез нуклеиновых кислот остается пока нерешенной задачей. Получены синтетические полинуклеотиды, которые отличаются от природных нуклеиновых кислот тем, что они являются полимерами только одного или нескольких ргуклеотидов, но с произвольным, неспецифическим их распределением в цепи. Гомогенные олигонуклеотиды синтезируют обычно поликонденсацией мононуклеотидов под действием дициклогексилкарбодиимида [c.366]

Есть ли необходимость в создании новых генов Оказывается, да. Мутации происходят часто, но сохраняются очень немногие, и далеко не все они благоприятны. А управляемый мутагенез позволяет обойти эти трудности как по существу мутации, так и по времени ее появления. Еще одним важным достижением биоорганической химии и генной инженерии является химический синтез олигонуклеотидов, практически генов. Первый ген из 150 нуклеотидных пар синтезировал в 1967 г. X. Г. Корана и его сотрудники. Это был гея одной из тРНК. Х.Г. Корана первым осуществил так называемый блочный синтез, когда одна половина блока [c.61]

С появлением приборов для автоматического химического синтеза ДНК (ДНК-синтезаторов) получение одноцепочечных олигонуклеотидов длиной <50 звеньев стало более или менее рутинной процедурой. Основным компонентом любого ДНК-синтезатора является система клапанов и насосов, с помощью которых в реакционную смесь по строго заданной программе вводятся нуклеотиды и реагенты, обеспечивающие присоединение нужных мономерных единиц к растущей цепи. В отличие от биологического, в ходе химического синтеза ДНК каждый новый нуклеотид можно присоединять к 5 -гидроксильному концу цепи. Все реакции осуществляются последовательно в одной реакционной колонке, а продолжительность каждой из них и время отмывания контролируются с помощью компъютера. [c.80]

Чтобы выход продукта был достаточно высок, эффективность присоединения нуклеотидов на каждом этапе должна быть не ниже 98%. Эффективность контролируют спектрофотометрическими методами, определяя количество удаляемых тритильных групп. Если, например, при синтезе 20-членного олигонуклеотида эффективность каждого цикла равна 99%, то 82% (т. е. 0,99 100) олигонуклеотидов будут иметь именно такую длину. Если же синтезируется 60-членный олигонуьслеотид, то при той же эффективности только 55% олигонуьслеотидов будут содержать по 60 нуклеотидов. А если средняя эффективность цикла не превышает 98%, то доля олигонуклеотидов заданной длины будет гораздо ниже (табл. 5.1). Фирмы - изготовители коммерческих ДНК-синтезаторов обычно гарантируют среднее значение эффективности присоединения 98%. Но для этого необходимо использовать реагенты и химикаты очень высокой степени чистоты, что не всегда удается выполнить. Как правило, реальная эффективность присоединения составляет 95%, хотя иногда удается достичь и 99%-ной эффективности. Чтобы получить олигонуклеотиды заданной длины, первичные продукты большинства химических синтезов необходимо очистить с помощью либо высокоэффетивной жидкостной хроматографии под высоким давлением с обращенной фазой, либо электрофореза в полиакриламидном геле. Поскольку все неудачные последовательности короче, чем тот олигонуклеотид, который хотят получить, сделать это нетрудно. [c.85]

Рис. 8.5. Химический синтез олигонуклеотидных праймеров, содержащих в определенных сайтах разные нуклеотиды. В данном случае в сосуде с G-фосфо-рамидитом (94%) содержатся также фосфорамидиты А (2%), С (2%) и Т (2%), так что в результате реакции образуется смесь олигонуклеотидов, в которых в тех сайтах, где должен находиться G, присутствуют А, С или Т.

С разработкой в начале 80-х гг. быстрых, эффективных и недорогих методов химического синтеза олигонуклеотидов появилась возможность использовать радиоактивно меченные олигонуклеотидные зонды для выявления различий между нуклеотидными последовательностями, в частности для обнаружения мутаций у человека. К тому времени было изолировано относительно небольшое число генов, главным образом в виде комплементарных ДНК (кДНК), поэтому подбор зонда, гомологичного конкретному гену, представлял собой непростую задачу. Но даже если соответствующие кДНК были получены, невозможно было различить нормальный и мутантный гены чело- [c.189]

Ключевой стадией химического синтеза олигонуклеотидов является создание фосфодиэфирных связей между нуклеотидами. Можно выделить два основных подхода к решению этой задачи. Один из них использует в качестве источника фосфатной группы моноэтерифицированные фосфаты (фосфомоноэфиры), а другой — диэтерифииированные фосфаты (фосфодиэфиры). [c.354]

Олигорибонуклеотиды. Методы химического синтеза в этом ряду соединений разработаны значительно меньше, чем в случае олигодезоксинуклеотидов. Относительно доступными являются лишь тринуклеозиддифосфаты синтезу же олигонуклеотидов [c.93]

Рибонуклеаза панкреатическая — фермент осуществляющий гидролиз дрожжевой РНК. Обнаружен Джонсом в панкреатической железе. Это термостабильный белок небольшого размера с мол. массой 13 700, устойчив при кислых значениях pH, но в щелочной среде очень легко инактивируется. Панкреатическая РНК-аза расщепляет РНК с образованием З -монофосфатов или же олигонуклеотидов с З -фос тным нуклеотидом на конце. Оптимальную активность фермент проявляет при pH 7,0— 8,2. При температурах выше 65° С панкреатическая рибонуклеаза инактивируется. В результате структурных исследований волностью расшифровано первичное строение этого белка-фермента и осуществлен его полный химический синтез. Панкреатическая РНК-аза расщепляет связь между фосфатом, присоединенным к атому С-З -пиримидинового нуклеотвда, и С-5 -кислородом соседствующего с ним нуклеотида. Внутримолекулярная атака фермента на фосфодиэфирную связь происходит при участии 2 -гидроксильной группы. При этом обязательно образуется промежуточный 2 -3 -циклофосфат, который затем гидролизуется тем же ферментом с образованием свободного пиримидин-З -фосфата или же Олигонуклеотида с пиримидин-З -фосфатным нуклеотидом на конце. Нельзя считать абсолютной специфичность панкреатической РНК-азы по отношению к пиримидиновым нуклеотидам, поскольку диэфирные связи в полинуклеотиде, возникающие при наличии Аф, также расщепляются ферментом, хотя и в значительно меньшей степени, чем фосфодиэфирные, образующиеся пирими-динами. [c.75]

В результате нуклеофильной атаки по атому фосфора образуется ковалентная фосфодиэфирная связь (фосфатный мост). Без комплементарного полинуклеотида концевые амидофосфатная и гидроксильная группы олигонуклеотидов не взаимодействуют, не могут сблизиться из-за сложности пространственной структуры реагирующих олигонуклеотидов. Предложенная реакция, имеющая черты ферментативного процесса (направленное сближение реагирующих групп в пространстве, результатом чего является их взаимная активация), открывает возможность осуществления полностью химического синтеза генетического материала в условиях, близких к природным. [c.697]

Прежде чем перейти к описанию получения двуцепочечных фрагментов ДНК, несущих единственную метку на одном из концов, все же необходимо упомянуть о Других одноцепочечных фрагментах ДНК, синтезируемых химическим путем, - олигонуклеотидах, точность синтеза которых иногда проверяют секвенированием. Следует отметить, что после мечения 5 -конца синтезированного одноцепочечного олигонуклеотида с помощью полинуклеотидкиназы (причем предварительное дефосфорилирование в данном случае не требуется, так как в результате синтеза 5 -конец олигонуклеотида не несет остатка фосфорной кислоты) образуется сразу пригодный для секвенирования фрагмент ДНК с меткой на одном конце. [c.25]

Завершая рассмотрение различных олигонуклеотидных праймеров, следует упомянуть о предъявляемых требованиях к их качеству. Праймеры являются довольно критичным компонентом секвенирующих реакций. Как уже отмечалось выше, читабельность радиоавтографа геля или однозначность результатов, получаемых в автоматическом сек-венаторе ДНК, будет зависеть от гомогенности 5 -конца праймера. Поскольку при химическом синтезе олигонуклеотидов, начинающегося с З -конца, эффективность каждой реакции присоединения очередного звена никогда не составляет 100%, то неочищенный продукт будет представлять собой смесь основного продукта и более коротких олигонуклеотидов. Легко подсчитать, что чем длиннее будет синтезируемый олигонуклеотид, тем ниже содержание основного продукта. В связи с этим очищенные праймеры будут давать более лучшие результаты, но очистка праймеров требует дополнительных усилий и значительно увеличивает их стоимость. Что касается коротких модульных праймеров (5-, 6-, [c.75]

Как уже отмечалось в главе 2, усовершенствование химического синтеза олигонуклеотидов, сделавшее их более доступными, легло в основу стратегии секвенирования, названной подходом с использова- [c.281]

Использование синтетических олигонуклеотидов. Другой методический подход, применяемый для определения места расщепления рестриктаз, стал доступен благодаря созданию эффективных методов химического синтеза олигодезоксрибонуклеотидов. Основной прогресс в этой области был связан с разработкой более совершенного фосфотриэфирно-го [256] и фосфоамидитного методов [175] и перехода от синтеза в растворе на синтез с использованием полимерных носителей [71, 175]. [c.179]

Следующим щагом в развитии методов химического синтеза генов стало создание специализированных компьютерных программ, которые позволят оптимизировать структуру олигонуклеотидов, чтобы свести к минимуму образование комплексов, приводящих к появлению побочных продуктов. Одним из первых примеров использования такой программы для выявления самокомплементарных и повторяющихся последовательностей оснований служит работа по синтезу гена эпидермального фактора роста, предназначенного для экспрессии в клетках Е. oll. Целевой ген, кодирующий 53 аминокислоты, был разбит на 23 олигонуклеотида. На рис. 1.42 приведен фрагмент составленной с помощью ЭВМ схемы последовательной сборки целевой ДНК из 17 промежуточных блоков-интермедиатов, каждый из которых был выделен в индивидуальном состоянии. Несмотря на оче- [c.63]

Известно, что промоторы ранних генов Р25 и Р26 фага Т5 имеют высокую аффинность к РНК-полимеразе Е. соИ и являются очень сильными конститутивными промоторами. Чтобы сделать промотор гена Р25 регулируемым, Т. Шибуи с сотрудниками (1988 г) с помощью химического синтеза олигонуклеотидов и клонирования создали промотор p ,a (см. рис. 3.2). Данный промотор подвергается регуляции, как промотор /ас-оперона, и при этом эффективно функционирует при индукции ИПТГ он направляет экспрессию встроенного гена в 3 раза эффективнее, чем р с- В векторные плазмиды с такими сильными промоторами необходимо вводить эффективно функционирующие терминаторы транскрипции, чтобы процесс считывания мРНК со встроенного в вектор гена не интерферировал с другими функциями плазмиды. [c.146]

Методология химического синтеза олигонуклеотидов в настоящее время вышла на такой уровень, что позволяет синтезировать целые гены, осуществлять in vitro тонкие перестройки генетического материала. Это открывает широкие возможности для конструирования эффективных микробиологических продуцентов био- [c.166]

Блестящие успехи в разработке методов химического синтеза олигонуклеотидов, доступность высокоочищенных ферментов нуклеинового обмена привели к тому, что процедуры сайтспецифического мутагенеза могут при необходимости применяться в любой молекуляр-но-биологической лаборатории. Данные методы стали неотъемлемой частью исследований, направленных на изучение структурно-функциональной организации генов и белков. Некоторые из этих работ рассмотрим в следующей главе. [c.185]

Благодаря разработке и совершенствованию методов клонирования и идентификации генов, секвенирования последовательностей ДНК, химического синтеза олигонуклеотидов, направленного мутагенеза молекул ДНК in vitro и оптимизации экспрессии целевых генов в клетках Е. соИ появилась возможность создавать мутантные формы генов и нарабатывать в достаточных для анализа количествах соответствующие им измененные варианты изучаемых белков. В целом направление исследований по конструированию методами генетической инженерии белков с измененными по отношению к природному прототипу свойствами, химерных белков, обладающих свойствами двух или более отдельных белков, и т. п., т. е. создание неприродных вариантов бежов и изучение их свойств, получило название белковая инженерия . [c.187]

Химический синтез гюлидезоксинуклеотидов. Для химического синтеза полидезоксинуклеотидов щироко применяют два метода. В обоих случаях исходными строительными блоками являются дезо кс при б онуклеоз иды, и оба метода включают этап связывания мононуклеотидов и олигонуклеотидов. Методы полностью автоматизированы при этом используется установка Синтезатор ДНК . [c.280]

Вся полимеразная цепная реакция осуществляется in vitro с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотид ных праймеров, комплементарных двум З -концам участков, офаничивающих ампли-фицируемый дуплексный сегмент. Таким образом, разработка НЦР-метода стала возможной лишь после того, как были созданы методы быстрого и недорогого химического синтеза олигонуклеотидов (разд. 6.1.в). Для осугцествления реакции необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка, который мы хотим амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры. При творческом применении НЦР-метода он существенно дополняет методы молекулярной генетики, и если бы часть II книги не была фактически завершена до того, как этот метод был окончательно разработан, его основы были бы обязательно изложены в гл. 5-7. [c.360]

Огромный вклад в дело химического синтеза олигонуклеотидных блоков с заданной последовательностью внес уже упоминавшийся Х.Г.Корана, которому вместе с коллегами пришлось преодолеть многочисленные трудности. Так, 60-е и начало 70-х годов двадцатого столетия были периодом фосфодиэфирного синтеза, который позволил сдвинуть весь этот пласт, но оказался непригоден для широкого использования из-за своей крайней медлительности, поскольку средняя скорость нарагцивания олигонуклеотидной цепи этим методом составляла одно звено в месяц. Более того, осугцествить подобный процесс мог только высококлассный химик, обладавший к тому же адским терпением. С появлением в начале 70-х гг. фосфотриэфирного метода, скорость синтеза заметно возросла, что постепенно превратило процесс получения олигонуклеотидов в довольно рядовое событие. [c.12]

Поскольку полинуклеотидные цепи, составляющие ДНК, образуются за счет соединения в единое целое дезоксирибоз и остатков фосфорной кислоты (формирующих так называемые фосфодиэфирные связи), а также азотистых оснований, то в процессе химического синтеза олигонуклеотидов оказывается возможным в любой из этих трех компонентов вносить определенные изменения. Однако, чтобы с помощью ДНК-синтезатора изготовить модифицированный по тому или иному компоненту олигонуклеотид необходимо предварительно синтезировать содержащий новую группу соответствующий фосфорамидит, называемый синтоном, или просто купить его, так как уже существует немало фирм, занимающихся не только заказным [c.61]

Разработаны методы синтеза полинуклеотидов — простейших моделей нуклеиновых кислот. Эти методы послужили основой для синтеза олигонуклеотидов с заданной последовательностью нуклеотидов. Использование химических и биохимических методов синтеза дали возможность Каране получить полинуклеотид, соответствуюший активному фрагменту дезоксирибонуклеиновой кислоты. Все эти достижения в области исследования строения, функций и синтеза биополимеров позволили на другом, новом—молекулярном уровне подойти к изучению жизненных процессов. Есть все основания предполагать, что в ближайшее время нас ждут большие и интересные открытия в мире познания самых сложных и тонких областей жизнедеятельности организма (деятельности нервной системы, межклеточного взаимодействия, явлений иммунитета и т. д.). [c.54]

В настоящее время методы синтеза олиго-. и полинуклеотидов разработаны в такой степени, что в короткие сроки могут быть получены искусственные фрагменты ДНК большой длины и практически любого состава. Достигнут существенный прогресс и в синтезе полирнбонуклеотидов. Общая стратегия синтеза полинуклеотидов и нуклеиновых кислот заключается в комбинированном использовании химических и ферментативных методов. Относительно небольшие олигонуклеотиды синтезируют химически, а затем соединяют в длинные цепн с помощью соответствующих ферментов. [c.348]

С развитием методов синтеза олигонуклеотидов стало возможным получать чисто химическими способами 30 — 60- и даже 100-звеиные олигомеры. С одной стороны, это привело к упрощению описанной методологии (за счет существенного сокращения числа лигазных реакций при сборке геиа), а с другой — создало основу для разработки принципиально иного подхода к получению синтетических дуплексов. Такой подход, предложенный К. Итакура и сотр., заключается в репаративной достройке с помощью ДНК-полиме- [c.371]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология