Центрифугирование в силиконовом масле

Методика разделения должна быть достаточно быстрой, чтобы исключить артефакты, связанные с перераспределением индикаторов в процессе разделения. В методике должно учитываться также остаточное загрязнение органелл средой инкубации. Наиболее широко применяются два метода разделения центрифугирование через силиконовое масло (рис. 4.5) и филь- [c.74]

ИЛИ обмена меченых метаболитов между внешней средой и матриксом митохондрий. Высокая скорость, с которой выравниваются концентрации метаболитов в матриксе и внешней среде, требует применения быстрых методов для изучения кинетики транспорта. Чаще других используют технику центрифугирования органелл через силиконовое масло (рис. 4.5). Временное разрешение метода можно повысить, если останавливать транспорт перед центрифугированием добавлением специфического ингибитора. С помощью этого подхода можно достичь временного разрешения менее одной секунды. В настоящее время разработаны автоматические системы, позволяющие последовательно отбирать ряд образцов из инкубационной смеси и определять таким образом кинетику транспорта. [c.165]

Рис. 8.6. Новый метод, разработанный Робинсоном для быстрого отделения цитоплазмы и хлоропластов от изолированных протопластов. Суспензию протопластов помещают в верхний контейнер, где их можно освещать или подвергать иной обработке. В нулевой момент времени их разрушают центрифугированием через сетку с диаметром отверстий 20 мкм. Цитоплазма остается над слоем силиконового масла, а хлоропласты проходят через него в денатурирующий раствор. Данный метод позволяет быстро определять распределение метаболитов между этими двумя фракциями при фотосинтезе или дыхании.

По данным, полученным путем центрифугирования в силиконовом масле, ФЕП конкурентно ингибирует (/(1 = 0,45 мМ) поглощение (Км = 0,2 мМ) в хлоропластах мезофилла [c.374]

Пластичные смазки, содержащие в качестве загустителя также высокоплавкие воски, церезины, парафины, полимеры, бентонитовые глины кизельгур, дисульфид молибдена и т. д., а в качестве дисперсионной среды — синтетические масла, разделяют центрифугированием после предварительного селективного растворения масляной части смазки подходящим растворителем и фильтрования [571, 572]. В частности, при наличии в смазке силиконовой жидкости, фтор-производных углеводородов и минерального масла в качестве растворителя применяют бензол. Неорганические составляющие смазки могут адсорбировать полярные части смазки. Для полного отделения последних осадок после первого центрифугирования подвергают повторному центрифугированию при разбавлении диэтиловым эфиром, ацетоном или метанолом. После отгона растворителей выделенную органическую часть смазки (минеральное масло, полимеры и т. д.) подвергают жидкостному хроматографическому разделению на силикагеле или окиси алюминия. При этом минеральное масло элюируют из слоя адсорбента к-гексаном и бензолом, а полярную часть смазки — диэтиловым эфиром, ацетоном, метанолом или смесями этих растворителей. [c.339]

Рис. 2.3. Приспособление для фракционирования градиентов плотности после центрифугирования. Черная стрелка в каждом случае указывает направление вытекания фракций градиента, а белая — направление потока минерального масла, используемого для вытеснения градиента, п — пробка с — трубка из нержавеющей стали ш — силиконовый шланг ст — стеклянная трубка. Детали работы с данным устройством приведены в тексте

Рис. 4.5. Определение Дгр с помощью центрифугирования митохондрий через силиконовое масло. Митохондрии инкубируют в среде, не содержащей К+, в присутствии валиномицина, Rb+, С-сахарозы и НгО. Аликвоту суспензии помещают в небольшую пробирку, содержащую силиконовое масло, и центрифугируют при 10 000 g в течение 1 мин. Митохондрии образуют под слоем масла осадок, который можно затем растворить для жидкостно-сцинтил-ляционного счета. Определяют также радиоактивность в надосадочной жидкости. Наличие в среде С-сахарозы позволяет определить доступный для сахарозы объем в осадке (Ксах). Он соответствует загрязнению осадка вне-митохондриальной средой инкубации. Разность между объемом, доступным для НгОС в), и V ax дает величину объема, недоступного для сахарозы, который соответствует объему матрикса (так как через внутреннюю мембрану проникает не сахароза, а вода). Если теперь определить в осадке кажущуюся величину объема, доступного для eRb (Vm), то по уравнению Нерн-

Для фотосинтеза у С -растений необходимо, чтобы опреде-ленпые метаболш ы С4-ц.икла быстро переносились через оболочку хлоропластов и митохондрий. О механизме транспорта метаболитов, особенно в хлоропластах обкладки проводящих пучков и в митохондриях, мало что известно. Связь транспорта метаболитов с С4-ЦИКЛ0М была изучена в опытах с хлоропластами мезофилла С -растений. Для этого регистрировали иа спектрофотометре при 535 им осмотические изменения объема хлоропластов под влиянием субстрата н оценивали методом центрифугирования в силиконовом масле поглощение метаболитов хлоропластами или их отток в окрулсающую среду. [c.371]

Метод центрифугирования в силиконовом масле можио использовать для выяснения механизма обмена веществ в ходе транспорта и для изучения кинетики этого процесса. Если использовать физиологические коицеитрации метаболитов, то можно далее различить поглощение за счет диффузии и поглощение с участием переносчика. В отличие от диффузии транспорт, опосредуемый переносчиком, характеризуется кинетикой с насыщением нри высоких концентрациях субстрата (обычно в пределах 10 мМ). Ему свойственна высокая чувствительность к температуре, а метаболиты, транспортируемые одинм и тем же переносчиком, обычно конкурируют друг с другом. Поглощение, опосредуемое переносчиком, подавляется некоторыми сульфгидрильиыми реагентами. [Сульфгидрильные реагенты взаимодействуют с сульфгндрильными группами белков п таким образом мешкают белку выполнять его каталитическую функцию.] Ингибирование поглощения, напрнмер специфическими аналогами субстрата, таклсе служит доказательством участия в этом процессе переносчика. [c.372]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология