Культура протопластов

Культуру протопластов на начальной стадии ее роста заражают агробактериями, которые используют в качестве векторов. [c.148]

Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токсических веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным. [c.143]

Что касается первого требования, то можно следить за стадиями (хронологический порядок которых приведен в табл.2.2) во время становления культуры протопластов и подсчитать процент жизнеспособных клеток на каждой стадии в любой клеточной популяции. [c.149]

Ежедневно наблюдают за культурой протопластов с помощью инвертированного микроскопа. Оценивают процент протопластов, для которых характерны определенные процессы (разд. 2.8.1), например образование стенки, первое деление и т. д. [c.150]

Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же среды, на которых растут изолированные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у протопластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолированная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов сопряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбриогенез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией последовательного образования корней и побегов (органогенез) добились регенерации растений табака, петунии и некоторых других растений. Следует отметить, что протопласты, изолированные из генетически стабильной клеточной культуры, чаще регенерируют растения и с большим успехом используются при исследованиях генетической модификации протопластов. [c.178]

В табл. 17.1 перечислен ряд методов трансформации однодольных растений. Некоторые из этих методов требуют удаления клеточной стенки с образованием протопластов. Последние поддерживают в культуре как независимо растущие клетки или в специальной питательной среде, где они образуют клеточные стенки из таких клеток может быть регенерировано целое растение. Кроме того, разработаны методы трансформации, позволяющие вводить клони- [c.379]

Еще 15 лет назад был разработан метод гибридизации соматических клеток для проведения генетических исследований на клеточных культурах. На его основе была создана методика генетической рекомбинации путем искусственно вызываемого слияния протопластов ее уже удалось с успехом применить на материале грибов и растений. Первичный продукт такого слияния-клетка, объединяющая в себе геномы обеих родительских клеток. [c.471]

В жизнеспособности выделенных протопластов большую роль играет физиологическая полноценность исходного растительного материала. Суспензионные культуры наиболее приемлемы для этих целей, будучи в конце логарифмической фазы роста (размножения). [c.516]

Методы усиления генетической изменчивости многообразны для этой цели используют культуру тканей, слияние протопластов, перенос одиночных генов, гаплоиды, опыление облученной пыльцой, химический мутагенез, замену митохондриальных и хлоропластных геномов и т. д. Направленный перенос распознаваемых признаков может быть осуществлен методами генетической инженерии. Здесь стоят проблемы выбора вектора, -включение гена в геном и экспрессии нового признака в условиях сложной системы регуляции у растений как на генетическом, так и на метаболическом уровне. [c.50]

Рис. 143. Использование тка-ни-"няньки" (суспензионная культура) при выращивании колоний из одиночных клеток кукурузы или протопластов (схема) 1 — качалоч-ная колба, 2 — колония, возникшая из отдельной клетки, 3 — фильтровальная бумага, 4 —металлическая сетка, 5 — суспензия клеток "кормящего слоя", 6 — подложка (пенополиуретан), 7 — питательная среда.

Слияние протопластов растений осуществляют с помощью ряда агентов, включая азотнокислый натрий, гидроксид кальция и ПЭГ. Наибольшая частота слияния наблюдается при действии ПЭГ, но гибриды, полученные в присутствии кальция, проще регенерировать в целое растение. Таким путем удалось получить межсортовые внутривидовые гибриды, гибриды между видами одного рода и даже разных родов. Опыты эти проводились на таких важных культурах, как картофель, табак и спаржа. [c.311]

Большое внимание привлекают к себе биологические способна снабжения растений фосфором, а также контроля за вредителями и болезнями растений. В этой области намечается переход, от лабораторных экспериментов к практике. Разрабатываются способы выращивания ценных культур в контролируемых условиях— это новый и многообещающий подход. Быть может, самый большой вклад, который может внести биотехнология в сельское хозяйство, — это улучшение сортов растений существенный прогресс здесь будет достигнут благодаря использованию методов генетической инженерии и технологии слияния протопластов. [c.351]

Другой метод, с успехом применяемый к картофелю, состоит в слиянии двух соматических (неполовых) клеток от разных сортов. Для этого у клеток сначала удаляют клеточные стенки, чтобы получить голые протопласты. Образующиеся в результате слияния протопластов соматические гибриды можно выращивать в культуре ткани. Это могут быть гибриды между двумя сортами, которые не удалось бы скрестить половым путем ввиду их несовместимости. Таким образом из дикорастущего картофеля были получены промышленные сорта, устойчивые к вирусу скручивания листьев и к холоду. [c.54]

Рис. 3.3. Использование в качестве няньки культуры суспензионных клеток при выращивании изолированных протопластов и одиночных клеток

Одиночная гибридная клетка, выделенная из культуры изолированных протопластов, при дальнейшем ее делении позволяет получить клон, состоящий из гибридных клеток. Это намного облегчает работу исследователя, так как устраняет необходимость отбора потомства в культуре изолированных протопластов от негибридных, что представляет значительные трудности. [c.95]

Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, из тканей растений, например, из мезофилла листа после его мацерации ферментами, из культуры изолированных протопластов после восстановления клеточной стенки. [c.95]

В последние годы достигнуты большие успехи, связанные с генетической трансформацией клеток, в том числе и растительного происхождения. Схема трансформации включает в себя получение протопласта, введение в него необходимой генетической информации, формирование полноценной растительной клетки, клонирование и регенерацию. (Подробно техника генно-и1гженерных экспериментов будет описана в следующем разделе.) В данной схеме трансформированный протопласт — суспензионная культура — каллусная культура — целое растение (рис. 31.4) — наиболее тех- [c.498]

Культура изолированных протопластов — выращивание протопластов на/в среде in vitro в присутствии стабилизатора. При регенерации клеточных стенок культура протопластов трансформируется в клеточную культуру. [c.495]

Рис. 6.2. Использование культуры суспензионных клеток в качестве кормящего слоя для выращивания изолированных протопластов и одиночных клеток кукурузы (Ву Дык Куанг, З.Б.Шамина, 1985)

Как можно применять биохимические методы для гибридизации in vitro культур протопластов [c.528]

В процессе образования корончатого галла агробактерии способны трансформировать клетки, прилежащие к поврежденной ткани, которые претерпевают клеточные деления в ответ на поранение. Клетки интактного растения, как правило, проявляют максимальный онкогенный ответ на инфекцию А. tumefa iens между 1,5 и 3 днями после поранения. У различных видов эта компетентная фаза совпадает с первыми клеточными делениями в ответ на поранение. Как было показано [50], раневой ответ можно имитировать в культуре тканей, если превратить покоящиеся мезофильные клетки листа или активно делящиеся клетки суспензионной культуры в протопласты и индуцировать регенерацию клеточной стенки и клеточное деление в соответствующей среде. В определенной фазе становления культуры протопластов клетки компетентны для трансформации Л. tumefa iens. Технология совместного культивирования предусматривает инкубацию протопластов в присутствии агробактерий в соответствующей жидкой питательной среде и позволяет получать большое число трансформантов в контролируемых условиях, Варьируя условия культивирования, плотность высева и изменяя процедуру селекции, можно получить трансформированные колонии клонального происхождения. Важно иметь в виду, что корончатые галлы — это смесь нетрансформированных и различных типов независимо трансформированных клеток и, следовательно, фенотип галла представляет собой сумму фенотипов всех клеток, обнаруживаемых в опухоли. Однако клеточная популяция трансформантов, полученных с помощью сов- [c.151]

Приготовление суспензионной культуры протопластов альбиноса Petunia hybrida описано в приложении 3[1]. Методики получения суспензионной культуры протопластов в других случаях и другие системы протопластов должны быть разработаны с помощью специальных экспериментов. [c.205]

Клеточные суспензии играют значительную роль в биотехнологии. Они могут бьггь использованы для получения изолированных протопластов, которые применяют для клеточной селекции, при введении чужеродных ДНК и других процессах. Клеточные суспензии культивируют в больших количествах для получения вторичных метаболитов, выявления новых веществ, для выращивания клеточной биомассы. Однако увеличение клеточной биомассы в результате деления клеток и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Поэтому необходимо хорошо знать физиологию, свойства клеток в суспензионных культурах, чтобы получить максимальный выход продукта. Состояние клеточных суспензий характеризуется плотностью клеточной популяции. За 14—16 дней (средняя длительность пассажа) плотность обычно повышается от 5- Ю до 5-10 кл/мл. Качество суспензии определяется степенью агреги-рованности. Агрегаты должны содержать не более 10 — 12 клеток. [c.167]

После получения различных сомаклональных вариаций от исходного растения наступает следующий этап — отбор необходимых сочетаний признаков. Данный вопрос решается с помощью клеточной селекции, которую проводят практически на любом объекте, введенном в культуру in vitro. Однако удобнее использовать суспензионную культуру или изолированные протопласты. Преимущество этих объектов состоит в быстром росте культуры и равномерном действии селективного фактора на все клетки. Для отбора сомаклональных вариаций соответствующие селективные факторы (соли в высоких концентрациях, гербициды и др.) добавляют в питательную среду для выращивания культуры клеток либо растущие культуры помещают в селективные условия (низкая или высокая температура, освещенность и т.д.). Существует несколько методов клеточной селекции [c.187]

Для трансформации дрожжей обычно используют три способа. В первом случае экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически (протопласты) (1). В других случаях клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития (2) или подвергают электропорации (3). Трансфекцию культур животных клеток осуществляют инкубацией клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕАЕ-декстраном (1), либо электропорацией в присутствии очищенной трансфицирующей ДНК (2). Как уже упоминалось в гл. [c.136]

При слиянии суспензию жизнеспособных протопластов двух культур помещают, например, в пульсирующее электрическое поле (электрослияние) либо добавляют полиэтиленгликоль и т.п. Такая процедура приводит к слиянию с достаточно высокой вероятностью. Для слившихся протопластов создают такие условия, когда они регенер1 руют, и отбирают среди образовавшихся колоний организмы, несущие наследственные признаки обеих культур. [c.102]

В последние годы все чаще применяют специальные емкости (сосуды) для изоляции в асептических условиях органов из молодых растений. Фирма Sigma ( IIIA) к 1990 г. ввела новые мембранные наборы для культур растительных тканей. Их изготавливают из микропористой полипропиленовой мембраны, обработанной специальным ПАВ для улучшения прохождения питательных веществ. Мембранные наборы могут быть использованы при культивировании протопластов, в соматическом эмбриогенезе, при получении культур цветов и в других направлениях. [c.501]

Исходные клеточные суспензии обычно получают из рыхлых, оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—100 мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактурона-зой, и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов кальция, но содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодическом, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях источниками суспензионных культур могут быть протопласты с реконструированными клеточными стенками. Стимулировать деления отдельных клеток изолированных протопластов можно с помощью обогащенных [c.508]

Томасу (Thomas, 1981) удалось получить культуры побегов тетраплоидного картофеля сорта Maris Bard, которые использовались как исходный материал для выделения протопластов [c.385]

Для опытов использовали трех- и четырехлетние яблони, выращенные в вегетационных сосудах (почвенная культура) при влажности ночвы 60% от полной влагоемкости и при внесении полной смеси минеральных удобрений. Подвой — Ийст Молинг типа XI привой — сорт Антоновка . Пробы брали в конце фазы листопада. Материал фиксировали в автоклаве, а затем у побегов и корней отделяли кору от древесины. Древесину высушивали до воздушно-сухого состояния и измельчали. Для анализов использовали абсолютно сухой материал. Измельченный материал извлекали 85%-ным этанолом (1 10) на кипящей водяной бане до тех пор, пока экстракт переставал давать положительную антроновую реакцию. Это служило критерием того, что из протопласта и стенок клеток выделялись все подвижные соединения, в первую очередь, сахара, а также подвижные фенольлые соединения. Полученные экстракты объединяли и прибавляли Ю—15 жл воды. Водный раствор сгущали в вакууме, и pH доводили до 3. Затем фенольные соединения трижды экстрагировали эфиром. Эфирный экстракт упаривали в вакууме. Остаток растворяли в этаноле, и полученный раствор хроматографировали как экстракт подвиншых ( свободных ) фенольных соединений (Л). Оставшийся после экстракции этанолом осадок доводили до абсолютно сухого веса и гидролизовали 2 н. НС] в течение часа на кипящей водяной бане. [c.239]

VI э т а п (1960—1975 гг.). Наиболее важным событием этого периода была разработка профессором Ноттингемского университета Э.К. Коккингом метода получения ферментативным путем изолированных протопластов из корней и плодов томата и культивирования их в контролируемых условиях. Позже в 1970 г. в той же лаборатории Пауэром и сотр. было осуществлено искусственное слияние протопластов, что открыло новый путь к созданию соматических гибридов. Еще один метод, разработанный в этот период,— это микроразмножение растений в условиях in vitro с использованием меристемной культуры. Первоначально этот метод был разработан французским ученым Ж. Морелем для получения оздоровленного посадочного материала орхидей. [c.79]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология