Получение делеций и вставок

Тот же принцип объединения двух фрагментов ДНК, перекрывающихся за счет праймеров, используется при получении делеций и вставок. Для создания делеции (на рис. 35,2 обозначена прямоугольниками на цепях ДНК) берут внутренние праймеры Ь и с, 5 -концы которых комплементарны матрице по одну сторону делетируемой последовательности нуклеотидов, а 3 -концы - последовательности нуклеотидов, фланкирующей другой ее конец. Образующиеся при этом продукты ПЦР АВ и СО перекрываются в точке делеции и далее используются как и в предыдущем случае. При получении вставок (см. рис. 35,5) применяют внутренние праймеры Ь и с, комплементарные друг другу своими 5 -концевыми частями, которые соответствуют образуемой олигонуклеотидной вставке во фрагмент матричной ДНК. 3 -Концы этих праймеров комплементарны участкам [c.296]

Получение ревертантов служит важной характеристикой, позволяющей отличать точковые мутации и вставки от делеций. Так, точковые мутации могут ревертировать в результате восстановления исходной пары оснований или какого-то изменения во вторичном сайте. Реверсия вставки может произойти путем удаления вставки. Делеция же части генетического материала не может быть [c.41]

Небольшие делеции в окрестностях сайтов рестрикции можно получать быстрее удалением липких концов линеаризованной плазмидной ДНК после рестрикции с последующим замыканием линейной ДНК в кольцо лигированием по образовавшимся тупым концам. В этом случае размер делеции соответствует размеру одноцепочечных липких концов в сайтах рестрикции. Кроме того, такой метод допускает простую проверку наличия мутаций в требуемом участке ДНК, так как в результате мутации происходит потеря уникального сайта рестрикции. Для получения вставок коротких или протяженных последовательностей нуклеотидов в исследуемые участки клонируемых генов также разработаны эффективные и надежные методы. В простейшем случае такая задача решается путем расщепления исследуемого гена рестриктазой по уникальному сайту рестрикции и встраивания по этому сайту фрагмента природной ДНК или синтетического двухцепочечного олигонуклеотида, который фланкирован соответствующими липкими концами. Лигирование может проводиться и по тупым концам. В таком случае последовательности нуклеотидов на концах вставки уже не имеют существенного значения для встраивания этого фрагмента по сайту рестрикции. [c.289]

Получение набора делеций разного размера, берущих начало от одного исходного сайта, находящегося во вставке. Сайт RE1 после образования кольцевых молекул не восстанавливается. Его положение в этих структурах указано стрелками, [c.345]

Рис. 8.17. Схема дельта-рестрикционного клонирования для создания однонаправленных делеций вставки и получения необходимых субклонов при секвенировании протяженных

Одним из типов двойных спиралей, которые получают искусственным путем, является гибрид ДНК—РНК. Оказалось, что молекулы информационной (матричной) РНК (мРНК) гибридизуются только с одной из двух разделившихся цепей ДНК, несущей участки, комплементарные мРНК. Метод гибридизации используется также для получения гетеродуплексов ДНК, в которых две цепи молекулы происходят от двух разных генетических линий одного и того же вида организмов. Известно, что некоторые мутации состоят в делеции (выпадении) или вставке одного или нескольких оснований в цепь ДНК. Гетеродуплексы, в которых одна из цепей нативная, а другая — со вставкой или делеци-ей, имеют по всей своей длине нормальную структуру по Уотсону—Крику, за исключением тех участков, где делеции или вставки нарушают комплементарность и образуются одноцепочечные петли (рис. 15-24). [c.143]

Ранее был предложен имеющий много общего с описанными выше методами подход к получению делеционных субклонов в одноцепочечном векторе, основанный на построении с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I комплементарной цепи участков вставки, имеющих разную протяженность [Burton et al., 1988]. В цитируемой работе осуществлялся отжиг олигонуклеотидного праймера, в результате ферментативного удлинения которого происходило увеличение двуцепочечного участка вставки, причем производимый по времени отбор аликвот данной реакции обеспечивал получение их разной протяженности (рис. 8.14). Далее остающийся недостроенным одноцепочечный участок вставки и самого вектора удалялся нуклеазой S1. Затем с помощью подходящей рестрикционной эндонуклеазы, сайт которой находился в полилинкере поблизости от места клонирования вставки, вырезались делетированные варианты вставки. Их дальнейшее лигирование с заранее приготовленным вектором проводилось с таким расчетом, что происходила реориентация вставки, позволяющая секвенировать фрагменты ДНК со стороны делеций, давая, таким образом, возможность получить перекрывающиеся участки секвенируемой последовательности ДНК. [c.263]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология