Экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы

Рис. 20.20. Концевое мечение двухценочечных ДНК с помощью ДНК-полимеразы Т4. З -экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы катализирует отщепление 3 -концевых нуклеотидов фрагментов ДНК с тупыми концами (А), с выступающими З -концами (F) или с выступающими 5 -концами (В). Отщепление происходит до тех пор, пока на противоположной цепи не экспонируется основание, комплементарное меченому дезокси-рибонуклеотиду, введенному в реакционную смесь (dGTP ) затем включается полимеразная активность ДНК-полимеразы Е4, и к 3 -концу присоединяется свободный меченый дезоксирибонуклеотид. Метка включается в оба конца фрагментов ДНК (на рисунке это не показано). Для мечения можно использовать любой дезоксирибонуклеотид.

ДНК-полимеразы проверяют комплементарность каждого нуклеотида матрице дважды один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь образуется лишь в том случае, если последний (З -концевой) нуклеотид затравки комплементарен матрице. Если же на предыдущей стадии полимеризации произошла ошибка (например, из-за того, что нуклеотид в момент полимеризации находился в необычной таутомерной форме), то репликация останавливается до тех пор, пока неправильный нуклеотид не будет удален. Некоторые ДНК-полимеразы обладают не только полимеризующей, но и 3 -экзонуклеазной активностью, "Которая отщепляет не спаренный с матрицей нуклеотид затравки. После чего полимеризация восстанавливается, от механизм, коррекция, заметно увеличивает точность работы ДНК-полимераз. Мутации, нарушающие З -экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы, существенно повышают частоту возникновения прочих мутаций. Напротив, мутации, приводящие к усилению экзонуклеазной актив- ности относительно полимеризующей, снижают темп мутирования Генетического материала. [c.47]

Рис. 28-15. Исправление ошибок с помощью У-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы.

РНК-затравочные участки не сохраняются в структуре зрелой ДНК. После реализации своей функции для инициации репликации ДНК они удаляются за счет проявления 5 З -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы (рис. 13.1, и 13.3). После удаления РНК-затравки и ее замещения на фрагмент ДНК, инициация синтеза которого происходит на следующей РНК-затравке, расположенной ближе к области репликативной вилки, между дву Мя соседними синтезированными фрагментами ДНК остается разрыв. Этот разрыв (отсутствие ковалентной связи между З -ОН- и 5 -Р04-концами фрагментов цепи) устраняется при участии фермента-ДНК-лигазы,-направляющего образование фосфодиэфирной связи (рис. 13.4). [c.107]

ДНК-полимераза фага Т4. Этот фермент обладает теми же активностями, что и кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I. Однако 3 ->5 экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы фага Т4 существенно более эффективна, особенно на однонитевой ДНК, поэтому для введения метки в рестрикты с З -выступающими (и, конечно, ровными) концами лучше использовать эту полимеразу. Метод основан на том, что после дефадации однонитевого участка фермент в присутствии определенного нуклеотида отщепляет мономерные звенья с З -концов фрагментов до тех пор, пока в дву-нитевои ДНК не встретится одноименный нуклеотидный остаток. После этого он замещается аналогичным нуклеотидом, присутствующим в среде. В результате образуются либо ровные концы [c.179]

Какие условия в эксперименте определяют включение полимеразной или экзонуклеазной активностей ДНК-полимераз [c.187]

Корреляция между частотой мутации и экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы фага Т4 [11] [c.341]

Таким образом, 3 -5 -экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы играет важную роль в обеспечении точности полимеризации, направляемой матрицей. Эффективность, или число оборотов, данной экзонуклеазы в оптимальных условиях составляет 2 % от числа оборотов субъединицы с полимеразной активностью. [c.24]

Рис. 24.28. 3 —>5 -экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I. [c.25]

Они обладают 3 —>5 -экзонуклеазной активностью. ДНК-полимераза HI (но не II) является также 5 —>3 -нуклеазой. [c.27]

Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. У бактерий РНК-затравка удаляется нуклеотид за нуклеотидом благодаря 5 -> З -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. При этом каждый отщепленный рибонуклеотидный мономер замещается соответствующим дезоксирибонуклеотидом (в качестве затравки используется З -конец синтезированного на старой цепи фрагмента). Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З -ОН нового фрагмента ДНК и 5 -фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, к-рая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента-никотинамидадениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов). [c.253]

После завершения синтеза фрагмента Оказаки РНК-затравка (праймер) удаляется (нуклеотид за нуклеотидом) с помощью 5 - 3 -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I. По мере отщепления рибонуклеотидных мономеров каждый из них замещается на соответствующий дезоксирибонуклеотид в ходе полимеразной реакции, осуществляемой ДНК-полимеразой I (при этом в качестве затравки используется З -конед предыдущего фрагмента Оказаки). Новый фрагмент Оказаки присоединяется к отстающей цепи ДНК с помощью фермента ДНК-лигазы. Источником энергии для этой реакции у эукариот служит АТФ. ДНК-лигаза не может соединить две молекулы одноцепочечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемые ДНК-лигазой, должны быть частью двухцепочечной молекулы ДНК. [c.304]

Е. соИ или фага Т4. ДНК-полимераза I обладает способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5 3 путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз используется в генной инженерии для построения второй комплементарной цепи при добавлении фермента к одноцепочечной ДНК-матрице в присутствии праймера произойдет ее удвоение. Это свойство используется, например, при создании кДНК-библиотек. ДНК-полимераза применяется также для заполнения бреши в цепи ДНК, например, при застраивании фрагментов с выступающими 5 -концами. Экзонуклеазная активность ДНК-полимераз используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК. [c.24]

Ступенчатые концы фрагментов ДНК можно сделать ровными. Выступаюш ий З -конец можно гидролизовать нуклеазой 81 или нуклеазой из проростков золотистой фасоли. Но лучший результат достигается использованием 3 - 5 экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы фага Т4 в присутствии всех четырех [c.245]

И 5 -> 3, и 3 — 5 -экзонуклеазные активности ДНК-полимераз мешают проведению секвенирующих реакций и крайне нежелательны. Так, 3 -> 5 -экзонуклеазная редактирующая активность будет удалять только что включенные нуклеотиды, в том числе нуклеотиды с дидезо-ксирибозой (хотя и с меньшей скоростью), приводя в результате к неспецифической терминации растущих цепей ДНК и невозможности однозначного прочтения радиоавтографа геля. 5 —> З -экзонуклеазная активность может оказывать даже более серьезное отрицательное влияние на результаты секвенирования ДНК, заключающееся в удалении нуклеотидов на 5 -конце праймера, являющегося частью вновь синтезируемой цепи и приводя, таким образом, к образованию гетерогенных 5 -концов разделяемых гель-электрофорезом фрагментов ДНК. Результатом будет та же нечитаемая картина полос секвенируемой ДНК или даже полное ее отсутствие при использовании в качестве метки олигонуклеотидного праймера, меченного по 5 -концу. [c.80]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология