Нуклеаза специфичность

Участок матрицы, ассоциированный с ферментом, составляет около 60 нуклеотидов, однако область локального расплетения цепей будет короче, и точно оценить ее размер довольно трудно. Судя по чувствительности ДНК в открытом комплексе к нуклеазе, специфичной к одноцепочечным участкам, длина расплетенного участка равна 12 парам нуклеотидов (гл. И). Если же РНК-полимераз-ная реакция протекает на кольцевых двуспиральных молекулах ДНК, то протяженность неспаренного участка ДНК составляет 17 нуклеотидных пар. [c.135]

I или обратной транскриптазы. На этом этапе праймер не нужен, поскольку на З -конце первой структуры временно образуется шпилька варьирующей длины, которая и служит праймером. На последнем этапе эту шпильку разрезают с помощью нуклеазы, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК, и получают дуплексную р ЦНК. [c.285]

Нуклеаза, специфичная к одноцепочечной ДНК [c.359]

Другой пример влияния сверхспирализации на структурные превращения двойной спирали ДНК — образование крестообразных структур. Практически любая ДНК содержит инвертированные, или палиндромные, повторяющиеся последовательности длиной от нескольких п. о. до многих тысяч п. о. Теоретически можно представить себе превращение линейной двуспиральной формы палиндрома в крестообразную (рис. 19). Для релаксированной ДНК вероятность такого превращения ничтожна. Поскольку в ДНК с отрицательными сверхвитками этот переход энергетически выгоден, крестообразные формы in vitro обнаруживаются у всех исследованных сверхспирализованных ДНК с нормальной плотностью сверхвитков. (Экспериментально крестообразные структуры фиксируют по наличию однотяжевых петель в вершине шпилек , которые расщепляются нуклеазами, специфичными к однотяжевой ДИКО Вопрос о существовании крестообразных структур ДНК ш vito остается открытым. Скорость их юбразования очень мала, и, может быть, именно поэтому в клетке их еще никому не удалось обнаружить. [c.33]

Некоторые олигонуклеотиды наиболее удобно получать расщеплением соответствующих полимеров. Это относится к гомогенным олигорибонуклеотидам, легко получаемым кратковременным щелочным гидролизом соответствующих гомогенных полирибонуклеотидов, а также к олигорибонуклеотидам типа (Хр) Ур, которые легко получить, расщепляя продукт полимеризации ррХ и ррУ (под действием полинуклеотидфосфорилазы) нуклеазой, специфичной к остатку Ур. (Здесь X и V — остатки нуклеозидов.) Ряд ди-, три- и тетрануклеотидов может быть достаточно легко выделен из продуктов расщепления РНК под действием РНК-аз. [c.103]

У обоих фагов Одна цепь ДНК отличается от другой по плавучей плотности. Благодаря этому после плавления ДНК этих бактериофагов тяжелую и легкую цепи можно разделить при помощи центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Если теперь взять только тяжелые цепи ДНК, то благодаря тому, что Za -оперон был включен в геномы Я и ф 80 в противоположных ориентациях, лишь один участок этих цепей будет иметь комплементарные последовательности оснований. Это участок ДНК /ас-оперона. Тогда при гибридизации тяжелых цепей получается совершенный дуплекс только на участке Za -оперона, а остальные части цепочек останутся неспаренными (рис. 11.6, А). Их удаляли действием нуклеазы, специфичной к однонитевой ДНК, и таким образом получили ДНК генов лактозного участка Е. соИ в чистом виде (рис. 11.6, ). Эксперимент Дж. Беквита и других принято считать началом генной инженерии. Поскольку подход к выделению /ас-оперона весьма специфичен для бактерии Е. соН, его сменили другие приемы, применимые в работе с любыми организмами. [c.268]

Заполимеризовав в ПААГ денатурированную ДНК, можно выявить нуклеазы, специфичные для однонитевых ДНК. Можно также исследовать оптимизацию условий, необходимых для активности нуклеаз, варьируя состав буфера геля, или опробовать различные ингибиторы нуклеазной активности. С помощью кольцевых ДНК удается отличить эндонуклеазы от экзонуклеаз. Электрофорезу можно подвергнуть лизаты бактерий для выяснения содержания в них нуклеаз [Rosenthal, La ks, 1977]. Окрашивание бромистым этидием в описанных опытах можно заменить авторадиографией (см. ниже), если в гель заполимеризовать меченную нуклеиновую кислоту или синтетический полинуклеотид [Iborraet al., 1979]. [c.103]

Разработка изящной методики клонирования ДНК для получения большого количества точных копий специфических фрагментов ДНК (рис. 13.4) открыла в последнее время новые горизонты в изучении структуры, организации и функцип генома. Если расщепить двухцепочечиую ДНК одним из ферментов рестрикции (одной из нуклеаз), специфично узнающих и расщепляющих короткие последовательности нуклеотидов (4— [c.454]

Для связывания двухцепочечной ДНК с поверхностью клетки В. subtilis необходимо участие белка 38,5К. Этот белок специфичен для компетентного состояния клетки и имеет молекулярную массу 38,5 кДа. 1Сак показали Б. Вос-ман с соавторами (1988 г.), важное значение для дальнейших этапов трансформации играет белковый комплекс 70К, а также белки 14К и 28К. Расположенный на плазматической мембране комплекс 70К состоит из двух субъединиц специфичной нуклеазы 17К и двух субъединиц белка 18К, являющегося регулятором активности данной нуклеазы. (Полагают, что 18К ингибирует нуклеазу 17К, предотвращая чрезмерный гидролиз молекул ДНК.) Белки 14К и 28К также представляют собой нуклеазы, специфичные для компетентного состояния. Причем белок 14К образуется в результате процессинга нуклеазы 17К, а 28К является димером 14К. В целом следует констатировать, что пока понятны лишь отдельные моменты процесса хромосомной трансформации компетентных клеток бацилл. [c.235]

Исследование родства между клонированным сегментом ДНК и внутриклеточной РНК с помощью ДНК-РНК-гибридизациии специфичных к одноцепочечным ДНК Нуклеаз. Эюгперимент включает три этапа (рис. 7.41). На первом клонированный фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом (например, с помощью ник-трансляции см. рис. 4.18) и денатурируют. Можно также (и это более предпочтительно) использовать одноцепочечную ДНК. На втором этапе ДНК гибридизуют с выделенной клеточной РНК в растворе в условиях, благоприятных для образования ДНК—РНК-гибридов. Любые последовательности ДНК, присутствующие в клонированном фрагменте, но не представленные в РНК, остаются одноцепочечными. Их удаляют с помощью нуклеазы, специфичной к одноцепочечной ДНК. И наконец, гибридные молекулы денатурируют и подвергают гель-электрофорезу. Размер образующейся радиоактивной ДНК определяют с помощью радиавтографии, сравнивая положение исследуемой ДНК с положением молекул ДНК известного размера. [c.351]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология