Плазмидные ДНК электрофорез в геле

Препарат кольцевой плазмидной ДНК длиной 18 т. п. н подвергают полной рестрикции эндонуклеазой Кш I. Электрофорез в геле выявляет наличие фрагментов следующих размеров 5,0 4,0 3,5 3,0 1,5 и 1,0. Неполная рестрикция интактной плазмидной ДНК той же эндонуклеазой с последующим разделением фрагментов посредством электрофореза в геле показывает существование пяти фрагментов, обозначенных в порядке убывания размеров буквами от А до Е. Результаты последующей полной рестрикции этих фрагментов представлены в таблице. Постройте рестрикционную карту кольцевой плазмидной ДНК. [c.292]

При электрофорезе плазмидной ДНК в геле расстояния, которые проходят разные виды молекул, находятся в обратной зависимости от значений их молекулярной массы. Во всех публикуемых в настоящее время методиках используются либо вертикальные, либо горизонтальные пластинки с гелем, регулируемые источники питания и источники коротковолнового ультрафиолетового света. Электрофорезу подвергают даже частично очищенные лизаты (как правило, достаточно 10— 20 мкл). [c.139]

Рис. 15.1. Электрофорез в агарозном геле неочищенных лизатов, полученных из разных штаммов бактерий [8]. Образец I (слева) стандартные плазмидные ДНК с варьированием по мол. массе от 62-10 (самая верхняя полоса) до 1,8-10 (самая нижняя полоса). Образцы 2—7 плазмиды, содержащиеся в разных бактериальных штаммах. Хромосомная ДНК расположена в полосе, помеченной буквами Хр.

МИДУ, становятся чувствительными к этому антибиотику (рис. 36.4). Это позволяет легко отличить исходную плазмиду, обеспечивающую устойчивость бактерии-хозяина к обоим антибиотикам, от рекомбинантной формы. Чтобы получить еще более четкие доказательства того, что плазмидная ДНК действительно является химерной (несет вставку), можно сравнить размеры сконструированной плазмиды с исходной методом гель-электрофореза. Рекомбинантная плазмида, естественно, будет иметь боль-щий молекулярный вес. [c.41]

Рассмотрим теперь совсем недавний пример разделения ДНК и РНК. Здесь решалась более тонкая задача разделения НК, соизмеримых по своим размерам, а именно очистки ДНК плазмиды pBR 322 от примеси РНК. Присутствие РНК в препаратах плазмидной ДНК мешает протеканию некоторых ферментативных реакций и затемняет результаты введения концевой радиоактивной метки. Оказалось, что даже интенсивная обработка РНКазой (50 мкг/мл, 37°, 1 ч) не расщепляет РНК полностью, а лишь дробит ее на фрагменты, не обнаруживаемые электрофорезом в 1%-ном геле агарозы (они уходят вперед), но переосаждающиеся этанолом вместе с плаз-мидной ДНК. Кроме того, обработка РНКазой вообще нежелательна. Несмотря на предварительный прогрев, в ней остается небольшая [c.143]

Внесение разрыва в один из участков кольцевой плазмидной ДНК преврашает ее в линейную молекулу, как показано на рис. 19.1. Затем два конца этой молекулы могут быть присоединены к концам линейной молекулы чужеродной ДНК, что приводит к образованию кольцевой гибридной плазмиды. Формально не сушествует ограничений на длину встраиваемой в плазмиду чужеродной ДНК. Гибридная плазмида может сушествовать в бактериальной клетке неограниченно долгое время. Для выделения гибридной плазмиды из клетки, например с помощью гель-электрофореза, можно использовать такие ее свойства, как размер или кольцевое строение. [c.237]

Препарат кольцевой плазмидной Ж- одвергают действию указанных ферментов, а затем анализируют фрагменты при электрофорезе в геле. Используя представленную информацию, постройте карту рестрикции этой плазмидной ДНК. [c.291]

Определить количество копий плазмиды в клетках трансформированного штамма можно разными методами, но все эти. методы предполагают выделение суммарной дрожжевой ДНК с последуюш,им определением соотношения плазмидной и геномной ДНК. Относительно простой способ оценить число копий высококопийной плазмиды — сравнение интенсивности окрашивания бромидом этидия рестрикционных фрагментов, соответствующих плазмидной ДНК и ДНК рибосомных повторов в суммарной геномной ДНК. Если суммарную ДНК из трансформированных дрожжей обработать рестриктазой, расщепляющей плазмиду и выщепляющей рибосомный повтор, соответствующие рестрикционные фрагменты можно визуализировать, окрашивая бромидом этидкя агарозный гель после электрофореза. В УФ-свете эти полосы отчетливо высвечиваются над фоновым свечением всех остальных окрашенных бромидом этидия гетерогенных по длине рестрикционных фрагментов. В ДНК гаплоидной дрожжевой клетки содержится приблизительно 140 копий рибосомных последовательностей, содержание же плазмидной ДНК может быть оценено количественно при помощи денситометриче-ск го сканирования фотонегативов, полученных при съемке геля. Интенсивность окрашивания нормализуют относительно длины [c.232]

Качество электрофореза проверяют с помощью хемископа ), а затем гель фотографируют камерой Поляроид , снабженной красно-оранжевым фильтром. На рис. 5.1 показаны полностью рестрицированные и разделенные путем электрофореза образцы ДНК из разных источников. Полосы калибровочных фрагментов ДНК (ДНК фага 1, рестрици-рованная HitidWl) должны быть четкими и хорошо разделившимися (дорожка 1), чтобы при необходимости можно было бы построить калибровочную кривую. Если полосы разделяются плохо, разрешение можно повысить либо увеличив время, либо подобрав соответствующую концентрацию агарозы ") ). Препараты плазмидной ДНК, обработанной рестриктазой (дорожка 2), должны достаточно хорошо разделиться, чтобы дальнейшую работу, например приготовление проб (разд. 5.6) либо выделение определенных фрагментов (разд. 1.5), можно было бы проводить без затруднений и иметь незагрязненные препараты. При электрофорезе рестрицированной тотальной ДНК агробактерий обычно видно множество полос различной интенсивности (дорожка 3), тогда как при рестрикции геномной ДНК растительного или животного происхождения (дорожка 4) [c.283]

Электрофоретическое и хроматографическое разделение нуклеиновых кислот. Для дополнительной очистки плазмидной ДНК иногда применяют гель-фильтрацию на Сефакриле S1000 (крупнопористый синтетический аналог сефадекса) [66], а также электрофорез в агарозном геле. Следует отметить, что электрофорез в агарозном, полиакриламидном или смешанном агарознополиакриламидном гелях используют для определения размеров и выделения небольших фрагментов дцДНК, образующихся при [c.41]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология