Плазмида интеграция чужеродной ДНК

Как интеграция, так и экспрессия чужеродных генов может зависеть от конфигурации вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК. Кроме того, при бомбардировке микрочастицами высокомолекулярные плазмиды (>10 т. п. н.) могут фрагментироваться, поэтому уровень экспрессии чужеродных генов окажется ниже, чем в случае плазмид меньшего размера. [c.381]

Природная способность агробактерий переносить определенные последовательности ДНК в растительный гено.м была использована при конструировании ряда векторов для трансформации растений с учетом различных особенностей процесса трансформации под действием агробактерий. В начале 80-х годов многие группы исследователей модифицировали Ti-плазмиды таким образом, чтобы удалить все онкогены Т-ДНК. При этом было обнаружено, что кодируемые Ti-плазмидой онкогены не участвуют ни в переносе Т-ДНК в растительную клетку, ни в ее интеграции с ядерной ДНК. Следовательно, эти гены можно заменить, встроив вместо них чужеродную ДНК. При этом плазмида теряет онкогенные свойства. Следует, однако, отметить, что nos- или o s-гены представляют собой удобные маркеры для трансформации, поскольку ферментативную активность их продуктов легко тестировать. До настоящего времени не сообщалось [c.17]

Чтобы избавиться от такой многоступенчатости, в той же лаборатории разработали иной подход к получению и селекции рекомбинантных вирусов осповакцины, который оказался очень удобным и универсальным для введения инсерций, делеций или мутаций в любую область вирусного генома. В данном случае доминантный маркер gpt находится в гибридной плазмиде вне фрагмента вирусной ДНК, и поэтому он может включиться в вирусный геном только в результате одиночного кроссинговера (рис. 14.33), при котором интегрируется вся гибридная плазмида, а не только вирусный сегмент. (Интеграция из плазмиды чистого вирусного фрагмента является результатом двойного кроссинговера.) Структура генома рекомбинантного вируса, в который встроена вся плазмида, нестабильна из-за наличия протяженных тандемных повторов (например tk или tku см. рис. 14.33), и при снятии селективного давления по гену gpt в результате внутримолекулярной рекомбинации плазмидная часть с геном gpt исключается с высокой эффективностью, а чужеродный целевой ген или вводимое мутационное изменение сохраняется в составе стабильного варианта VA . Этот метод получил название временной доминантной селекции. Используя данный метод, в лаборатории [c.394]

Плазмида ol El (Mr 4,2 МДа) применяется для клонирования E oRI-фрагментов. При этом интеграция чужеродного фрагмента в участок узнавания E oRJ ведет к фенотипическому изменению клетки, прекращению синтеза колицина с сохранением иммунности к нему. Этот признак используют при отборе рекомбинантных трансформантов. [c.118]

Встройку чужеродных генов в геном клетки осуществляют с помощью специализированных плазмид, называемых векторами интеграции. Классическим вектором данного типа является плазмида, не способная реплицироваться в исследуемых клетках, но имеющая в своем составе сегмент ДНК, гомологичный определенному району бактериальной хромосомы. Многочисленные эксперименты показали, что плазмиды интеграции способны с высокой эффективностью рекомбинационно встраиваться в геном В. subtilis. При этом интеграция является гесЕ-зависимой и в большинстве изученных случаев происходит по модели Кэмпбелла, т. е. кольцевая молекула ДНК рекомбинирует с гомологичным участком бактериальной хромосомы в одной точке (участке) и целиком встраивается в геном клетки. [c.257]

В клетке плазмидные ДНК рекомбгаируют между собой и хромосомной ДНК. В результате плазмида может интегрироваться в хромосомную ДНК растения в индивидуальном или, чаще, в мультимерном виде. Встройка в хромосомную ДНК растений происходит случайным образом, как и в клетках млекопитающих. Метод бомбардирования позволяет осуществлять котрансформацию растений разными плазмидами, при этом плазмиды обычно встраиваются в геном растения как коинтегранты. На основании полученных результатов можно полагать, что механизм интеграции чужеродной ДНК в хромосомы клетки при прямом переносе плазмид, не содержащих протяженных областей гомологии с хромосомной ДНК, схож у растений, животных и дрожжей. [c.467]

К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]

Введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента. Проблема переноса чужеродных генов в геном растений существенно облегчается в связи с обнаружением Т1-плазмид почвенных агробактерий AgroЪa terium Ште/ааепз, позволяющих вводить чужеродные гены в геном двудольных и некоторых однодольных растений. В последнее время довольно широко, особенно для трансформации клеток однодольных растений, используется метод биобаллистической трансформации. Важно обеспечить экспрессию чужеродного гена в геноме растения-реципиента и стабильное наследование признака в поколениях. Экспрессия введенного гена зависит от ряда причин, в том числе от места интеграции гена в геном растения, последующего метилирования промоторной области и введенного гена и т.п. [c.50]

Хотя векторы, несушие два (или более) селектируемых маркера, и позволяют в большинстве случаев отбирать бактерии, содержащие гибридные плазмиды, по инактивации одного из маркеров, однако для этого требуется перенос клонов трансформантов с одной среды на другую методом отпечатков. Это трудоемкая операция, особенно при анализе большого числа клонов. Поэтому в настоящее время сконструированы векторы, позволяющие производить прямой отбор клонов, несущих гибридные молекулы. Для этого в векторную молекулу вводят ген, выражение которого в определенных условиях вызывает гибель кпетки. Инактивация этого гена путем интеграции в него чужеродной ДНК делает трансформанты, содержащие гибридные л-олекулы, жизнеспособ- [c.145]

Данное наблюдение позволило разработать методологию эффективной интеграции любых генов в различные области генома эмбрионов дрозофилы. Во внутреннюю область Р-элемента, клонированного в бактериальной плазмиде, встраивается фрагмент чужеродной ДНК. Полученная гибридная плазмида, у которой в результате встройки нарушается ген транспозазы Р-элемента, инъецируется в эмбрионы дрозофилы совместно с исходной плазмидой, несущей нативный Р-элемент, который выполняет функции помощника транспозиции. Выжившие эмбрионы анализируют на наличие в хромосомах интегрированных копий гибридных Р-элементов. Оказалось, что 20-25% таких эмбрионов могут содержать чужеродную ДНК, интегрированную в составе гибридного элемента. Причем интеграция происходит в разные хромосомы и в различные участки одних и тех же хромосом. Нативный и дефектный гибридный [c.430]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология