ДСН—ПААГ на бумаге

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются, современные методы электрофореза. В качестве носителей жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества, однако для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез, поэтому только он и будет подробно описан. [c.6]

Иногда для измельчения геля его растирают внутри обычного шприца вращением его поршня. На дно шприца предварительно кладут плотно прилегающий к стенкам кружок фильтровальной бумаги, через которую затем и продавливают экстракт. Используют и стеклянные гомогенизаторы малого объема. Можно продавливать предварительно измельченный гель через иглу шприца (21-го калибра для 1,8%-ного ПААГ и 16-го —для 7,5%-ного ПААГ). [c.153]

Операции окрашивания и отмывки гелей агарозы отличаются некоторым своеобразием, связанным с тем, что для их ускорения пластину агарозы целесообразно предварительно сжатьн высушить. Процедуру начинают с осаждения белков и вымывания амфолитов, для чего пластину помещают на 5 мин в водный раствор, содержащий 10,5% ТХУ и 3,5% сульфосалициловой кислоты. Уменьшение продолжительности этой обработки по сравнению с пластинами ПААГ оправдано значительно большей пористостью 1%-ного геля агарозы. Затем пластину промывают двумя сменами 96%-ного этанола (по 10 мин в каждой) и покрывают смоченным в этаноле листком фильтровальной бумаги. На него кладут еще 4—5 листков сухой фильтровальной бумаги, накрывают стеклянной пластинкой и прижимают ее грузом примерно в 1 кг. За 20 мин пластина геля заметно сжимается. Сняв груз и бумагу, гель агарозы подсушивают феном до состояния тонкой пленки. Эту пленку окрашивают в течение Ш мин 0,11%-ным раствором СВВ R-250 в смеси, содержащей 8% уксусной кислоты и 25% этанола, без подогрева, затем отмывают в трех сменах того же растворителя (по 10 мин) и снова высушивают. Закрепленная на прочной и гибкой пластмассовой подложке тонкая пленка окрашенного геля агарозы удобна для хранения и фотографирования. Из нее можно вырезать представляющие интерес треки сфокусированных белков. Если при ИЭФ использовали гель агарозы без подложки, то ее можно ввести при Высушивании, уложив на нее гель перед началом [c.44]

При выращивании без агара каллусные культуры можно высаживать на мостики из фильтровальной бумаги, которые при пересадке погружаются в жидкую питательную среду после автоклавирования либо в колбы на диски из пенополиуретана (поролона). Предварительно диски отмывают мылом, хорошо промывают водой, автоклавируют в дистиллированной воде, отжимают и затем, погрузив в питательную среду, вновь автоклавируют. Диски можно использовать многократно. Можно использовать также пластмассовые тарики. стеклянные бусы, ПААГ. [c.236]

Перед установкой на столик прибора готовой пластинки ПААГ или геля, полимеризованного на стеклянной пластинке в лаборатории, под них подкладывают специальный трафарет с сеткой, которую достаточно хорошо видно через гель (рис. 7). Это удобно как для параллельного расположения полосок фильтровальной бумаги, на которые накладывают электроды, так и для нанесения препаратов на поверхность геля, как описано ниже. Между трафаретом и охлаждающим столиком, а также между стеклом, на котором полимернзован гель, и трафаретом должен быть обеспечен надежный контакт для эффективного теплоотвода. С этой целью на поверхность, расположенную внизу, наливают немного керосина или парафинового [c.28]

Установку пластины геля агарозы в прибор для горизонтального электрофореза, наложение полосок фильтровальной бумаги, пропитанных электролитами, и электродов производят точно так же, как было описано для пластин ПААГ. Отметим только, что в качестве анолитов не следует использовать концентрированные растворы сильных кислот, так как они могут растворять агарозу. Фирма LKB рекомендует для этой цели 0,5 М раствор уксусной кислоты, а фирма Pharma ia —0,05 М раствор серной кислоты. В качестве католита можно употреблять [c.44]

После окончания электрофореза для освобождения от ДДС-Na пластину ПААГ вымачивают при комнатной температуре в течение часа в 0,15 М Na-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М Na I к 0,5% Тритона Х-100. Затем гель кладут на стопку фильтров, смоченных тем же буфером, но без Тритона Х-100, с верхней поверхности геля фильтровальной бумагой удаляют избыток влаги, кладут на него диазобумагу, затем несколько слоев сухой фильтровальной бумаги Whatman ЗММ , все это накрывают стеклом и прижимают грузом. За 1—2 ч при комнатной температуре, благодаря диффузии и вымыванию из геля поднимающимся вверх током жидкости ( блоттинг ) часть белков из геля переходит на ДБМ-бумагу и связывается с ней в тех местах, которые лежат непосредственно над белковыми полосами в геле. Эта техника подробнее была описана при рассмотрении методов электрофореза [Остерман, 1981]. [c.130]

Для качественных, прикидочных определений С (но не Н ) можно просто высушивать тонкие диски или кусочки ПААГ на поверхности стекловолокнистого фильтра или тонкой фильтровальной бумаги (30 мин -при 50° или 2 ч на воздухе) до состояния тонкой пленки и просчитывать ее, как считают осадки на фильтрах. Даже для можно таким образом получить выход радиоактивности около 10% [Leinen, Wittliff, 1978]. [c.223]

Энергия -излучения Р достаточно велика, чтобы его авторадиографию можно было вести прямо с влажной пластины геля. Оставив ПААГ для жесткости на одной из стеклянных пластин (или уложив гель агарозы на стеклянную или пластиковую подложку), его заворачивают в тонкую полиэтиленовую пленку и закладывают в кассету соответствующего размера. Затем в темноте накладывают на гель рентгеновскую пленку, мягкую прокладку и крыщку кассеты с пружинящими зажимами. Кассету заворачивают в черную бумагу и в таком виде экспонируют при выбранной температуре. Для последующего совмещения пленки с гелем на нем по углам делают отметки радиоактивными чернилами. На геле эти отметки видны невооруженным глазом, а на пленке появляется их авторадиографическое изображение. В качестве радиоактивных чернил можно использовать и обычные чернила, добавив в них какое-либо высокоактивное, меченное С соединение. [c.224]

Сканирование радиоактивных пятен торцевыми счетчиками на пластинках после ТСХ и бумаге после хроматографии или электрофореза одно время практиковалось широко, а затем былО вытеснено намного более чувствительными методами счета жидких сцинтилляторах. Однако фирме Berthold (ФРГ) удалось в такой степени усовершенствовать сканирующую аппаратуру и чувствительность торцевых газопроточных счетчиков, чтО метод вновь стал конкурентоспособным по чувствительности, а по своей экономичности и быстроте он имеет явное преимущества перед использованием жидкостных сцинтилляционных счетчиков для этой цели. Чувствительность метода возросла в такой мере,, что его можно успешно использовать и для сканирования высушенных пластин после электрофореза в ПААГ. [c.233]

Можно заполимеризовать субстрат и кофакторы в другом ( индикаторном ) геле на основе агарозы или импрегнировать ими фильтровальную бумагу. После окончания электрофореза белков в пластине рабочего ПААГ на его поверхность накладывают индикаторный гель или бумагу. Ферменты диффундируют в них из рабочего геля и обнаруживают себя соответствующей цветной реакцией. Габриель привел длинный список индикаторных цветных реакций для ферментов [Gabriel, 1971]. Во многих случаях в этих реакциях фигурирует восстановление НАД с дальнейшей передачей электрона на краситель. Удобно в качестве заключительного этапа реакции воспользоваться неферментативным восстановлением тетразолиевой соли до ее формазана, что дает сильно окрашенные и зачастую нерастворимые продукты (схема реакции приведена ниже), [c.102]

Нитроцеллюлоза сорбирует только щелочные белки. Распространение этого метода на любые белки связано с использованием так называемой диазобумаги , на которой предварительно закреплены афинные сорбенты, например антитела или антигены [Erli h et al., 1979]. Диазобумага была разработана и нашла. себе применение главным образом для гибридизации нуклеиновых кислот [Alwine et al., 1977], поэтому здесь нет места для описания ее особенностей. Отметим только способ переноса белков из ПААГ на диазобумагу. После электрофореза белков в системе Лэммли ДДС-Na вымывают из геля 0,15 М. Na-фосфатным буфером (pH 7,4) с 0,15 М Na l и 0,5% Тритона Х-100 при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем гель кладут на стопку фильтровальной бумаги в кювету, заполненную тем же буфером, накрывают диазобумагой, а ее — несколькими слоями сухой фильтровальной бумаги. Всю пачку прижимают через стеклян- [c.108]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология