Амплифицированные сегменты ДНК

Явление амплификации сегментов хромосомной ДНК у актиномицетов может быть использовано для конструирования интегративных амплифицирующихся векторов, в которых чужеродный ген включается внутрь АП. [c.169]

С помощью ПЦР можно амплифицировать in vitro сегменты ДНК длиной от 0,1 до 5-7 т.п.о. и более, а для получения положительного результата достаточно присутствия в реакционной смеси одной-двух копий амплифицируемой последовательности нуклеотидов (например, геномной ДНК, содержащейся в одной-двух соматических клетках). При этом теоретически нет необходимости в тщательной очистке матрицы, так как большинство находящихся в реакционной смеси белков и ферментов инактивируется в первых же циклах ПЦР и не оказывает влияния на протекание реакции при высоких температурах. [c.194]

Из всех этих моделей следует, в частности, что в месте соединения тандемно повторяющихся единиц появляется новый сегмент. Это не согласуется с амплификацией хорионического гена Drosophila, о которой шла речь в разд. 10.7.а в этом случае дополнительные копии ДНК не связаны ковалентно с остальным геномом и никаких новых сегментов не образуется. Новые последовательности в месте соединений обнаружены в AD-системе (рис. 10.90). Отметим, что они амплифицируются вместе с самой [c.311]

Химическая стимуляция амплификации. Имеются данные о том, что многие сегменты генома изредка подвергаются спонтанной случайной амплификации. Частота такой амплификации в культуре клеток (в отсутствие давления отбора) составляет не более 10 -на каждую амплифици-руемую единицу в одном клеточном поколении. Если учесть, что средняя длина амплифицируемой единицы составляет 10 п.н. и, таким образом, в геноме размером 10 п.н. содержится таких единиц и каждая из них может амплифицироваться, то большинство вновь образующихся клеток будут [c.314]

Таблица 10-5. Гибридизация специфических олигонуклеотидов с амплифициро-ванными сегментами РНК и ДНК из печени и кишечника (задача 10-28)

Разные ДНК-полимеразы осуществляют ПЦР с различной эффективностью. Так, для РоПК и ДНК-полимеразы фага Т4 степень амплификации быстро снижается, если размер амп-лифицируемого сегмента превышает 250 пн, в то время как ДНК-полимеразы Taq и фага Т7 способны с высоким выходом амплифицировать фрагменты, имеющие размер до 2000 пн. С помощью полимеразы Taq удается амплифицировать фрагменты ДНК размером не более 5 тпн. Это ограничение, по-видимому, обусловлено отсутствием у фермента корректирующей 3 -5 -экзонуклеазной активности. В ПЦР на стадии полимеризации Taq связывается с праймером и достраивает цепь на матрице. Изредка Taq ошибочно включает некомплементарный матрице нуклеотид, после чего скорость удлинения синтезируемой цепи снижается в lO -lO раз. Преодолеть эту проблему удалось, объединив Taq с другим термостабильным ферментом — полимеразой Piro o us sp. GB-D, обладающей корректирующей 3 -5 -экзонуклеазной активностью. Этот фермент может связываться с ошибочно включенным неспаренным нуклеотидом после диссоциации комплекса этого нуклеотида с полимеразой Taq и удалить его. Это позволяет [c.50]

Многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают молекулу ДНК несимметрично, в результате чего образуются взаимно комплементарные одноцепочечные концы. Любые два сегмента ДНК, имеющие такие концы, могут рекомбинировать in vitro. Если один из сегментов способен реплицироваться в соответствующей клетке-хозяине, то вся рекомбинантная молекула может быть клонирована и амплифицирована. В приведенном примере плазмидные ДНК соединены с двумя фрагментами, полученными с помощью рестриктирующих эндонуклеаз (верхняя часть рисунка). [c.209]

Вся полимеразная цепная реакция осуществляется in vitro с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотид ных праймеров, комплементарных двум З -концам участков, офаничивающих ампли-фицируемый дуплексный сегмент. Таким образом, разработка НЦР-метода стала возможной лишь после того, как были созданы методы быстрого и недорогого химического синтеза олигонуклеотидов (разд. 6.1.в). Для осугцествления реакции необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка, который мы хотим амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры. При творческом применении НЦР-метода он существенно дополняет методы молекулярной генетики, и если бы часть II книги не была фактически завершена до того, как этот метод был окончательно разработан, его основы были бы обязательно изложены в гл. 5-7. [c.360]

Полимеразная цешая реакция. Для того чтобы амплифицировать какой-то сегмент ДНК, синтезируют два олигонуклеотидных праймера, каждый из которых комплементарен одному из двух З -концов [c.360]

Разные варианты полимеразных цепных реакций. Как мы уже говорили, для проведения НЦР необходимо знать нуклеотидные последовательности, фланкирующие амплифицируемый сегмент. Это подразумевает, что НЦР-метод может применяться ТОЛЬКО при наличии предварительно клонированных и секвенированных сегментов ДНК. Однако с помощью относительно простых модификаций можно значительно расщирить возможности метода НЦР. В ОДНОМ из вариантов можно вьщелить определенный ген, если известна аминокислотная последовательность лищь короткого участка соответствующего очищенного белка. Например, синтезировав праймеры ДЛИНОЙ 20 пар нуклеотидов на основании данных о последовательности двух концов пептидного сегмента длиной в 20 аминокислот, можно амплифицировать геномный фрагмент длиной 60 П.Н. Вследствие вырожденности генетического кода при этом используют смесь праймеров с альтернативными основаниями в нужных положениях (разд. [c.361]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая амплифицировать специфический сегмент ДНК. Два олигонуклеотидных праймера, по одному для каждой цепи, ограничивают амплифицируемый сегмент. Вначале ДНК денатурируют, затем производят отжиг праймеров, после чего ДНК-полимераза катализирует удлинение цепи в присутствии четырех нуклеозидтрифосфатов (цикл 1). Второй и последующие циклы запускают повышением температуры, вызывая денатурацию дуплексных молекул. В каждом цикле количество нужного сегмента удваивается. После нескольких циклов в смеси преобладают дуплексы, соответствующие нужному сегменту (короткие молекулы ДНК). Реакция идет эффективно, если размер амплифицируемого сегмента не превышает 2 т.п.н. [c.363]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология