Секвенирование сегментов РНК

Секвенирование полных сегментов РНК.....Ю/ [c.7]

Конечные нуклеотидные последовательности индивидуальных сегментов РНК вируса гриппа представляют значительный интерес из-за их общего включения в транскрипцию, трансляцию и репликацию. Ограниченное прямое секвенирование 5 - и З -концов 8 сегментов РНК вирусов гриппа А выявило присутствие общей последовательности из 13 нуклеотидов на 5 -копце у каждого сегмента и общую последовательность из 12 нуклеотидов на З -конце каждого сегмента [64, 218, 258] (для некоторых штаммов обнаружен Ц- или У-остаток в 4-м нуклеотиде на З -конце). Кроме того, [c.37]

Секвенирование полных сегментов РНК [c.107]

Сегмент 8 РНК штамма PR8 был секвенирован в двух различных лабораториях i[7, 137, 138]. В выведенной последовательности белка NS1 выявляется разница в одной аминокислоте и в белке NS2 — разница в двух аминокислотах, возможно, вследствие разной истории пассирования вируса в двух лабораториях. [c.114]

Этот пептид в родительском вирусе занимает положения 51— в НА1 и имеет последовательность Иле-Цис-Асн-Асн-Про-Гис-Арг, однако, по данным его состава нельзя было сказать, какой именно из аспарагиновых остатков заменен на лизин. Поэтому был секвенирован участок сегмента РНК в варианте, кодирующем этот пеп- [c.135]

Последние данные изучения структуры генов и генных продуктов вирусов гриппа, а также информация, полученная при использовании моноклональных антител, позволили получить несколько важных сведений о поведении этого вируса. Например, ясно, что антигенный шифт не происходит вследствие прямой мутации одного подтипа в другой, в то время как антигенный дрейф осуществляется в результате точечных мутаций в генах. Однако частота мутаций поверхностных белков не превышает существенно соответствующую величину для внутренних белков. НА имеет по крайней мере четыре различающихся антигенных сайта, которые могут варьировать независимо, с патогенностью, зависящей частично от последовательности в НА, где происходит расщепление. Некоторые сегменты РНК имеют перекрывающиеся гены, использующие две рамки считывания. Результаты секвенирования подтверждают антигенную классификацию подтипов НА и NA. [c.155]

Эти ДИ РНК, которые далее были проанализированы, имели ту же полярность, что и вирусные сегменты РНК, и в отличие от большинства ДИ РНК несегментированного минус-цепочечного вируса, вируса везикулярного стоматита, не имели комплементарных концов. Методами гибридизации, олигонуклеотидного картирования и секвенирования РНК 5 - и З -концов было показано, что все изученные до настоящего времени 16 ДИ РНК имеют природу гена полимеразы (РВ1, РВ2, РА) [21, 23, 24, 44] и несут оба 5 - и З -геномных конца [23, 51]. Олигонуклеотидное картирование показало, что различные по размеру ДИ РНК могут быть генерированы из одного гена полимеразы и что последовательности меньших ДИ РНК не всегда являются составляющими больших ДИ РНК. Поэтому было высказано предположение, что по крайней мере некоторые ДИ РНК образуются из внутренних делеций гена полимеразы с сохранением обоих концов [23], Однако эти эксперименты [c.251]

В последнее десятилетие мы стали свидетелями целой серии ошеломляющих успехов в области молекулярной биологии. Разработка надежных методов клонирования, секвенирования и анализа экспрессии эукариотических генов углубила наши представления о структуре и регуляции активности гена, сделала более понятными механизмы многих наследственных болезней человека, В это же время быстро развивались и достигли значительных успехов методы картирования человеческих генов. В сентябре 1987 г. в Париже состоялась конференция по проблеме картирования генома человека. На ней было доложено о локализации в общей сложности 1360 генов и сегментов ДНК в специфических участках хромосом. Процесс накопления данных в этой области носит лавинообразный характер. Заметим, однако, что при этом исследования по молекулярному клонированию и картированию с помощью анализа сцепления и методами генетики соматических клеток находятся на разных операционных уровнях (рис. 1). [c.95]

Разные варианты полимеразных цепных реакций. Как мы уже говорили, для проведения НЦР необходимо знать нуклеотидные последовательности, фланкирующие амплифицируемый сегмент. Это подразумевает, что НЦР-метод может применяться ТОЛЬКО при наличии предварительно клонированных и секвенированных сегментов ДНК. Однако с помощью относительно простых модификаций можно значительно расщирить возможности метода НЦР. В ОДНОМ из вариантов можно вьщелить определенный ген, если известна аминокислотная последовательность лищь короткого участка соответствующего очищенного белка. Например, синтезировав праймеры ДЛИНОЙ 20 пар нуклеотидов на основании данных о последовательности двух концов пептидного сегмента длиной в 20 аминокислот, можно амплифицировать геномный фрагмент длиной 60 П.Н. Вследствие вырожденности генетического кода при этом используют смесь праймеров с альтернативными основаниями в нужных положениях (разд. [c.361]

Рис. 5. Расщепление рестриктазами крупного сегмента гена Р-цепи глобина кролика с образованием перекрывающихся фрагментов Секвенированне фрагмента 4, получаемого совместным действием рестриктаз Нае III К Нра 1. позволяет однозначно расположить друг относктельно Друга фрагменты I Н 2

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

М 13-векторов, содержащих перекрывающиеся субклонированные последовательности, значительно увеличивается. Чтобы решить эту задачу, были разработаны методы секвенирования двухцепочечных плазмидных ДНК, не требующие субклонирования. Плазмидную ДНК, содержащую нужную вставку, вьщеляют и отжигают с синтетическим олигонуклеотидным праймером, который гибридизуется с последовательностью в одной из цепей векторной ДНК, находящейся вблизи вставки. Затем осуществляют дидезокси-секвенирование, позволяющее идентифицировать первые 250-350 нуклеотидов вставки. Исходя из этих данных синтезируют второй олигонуклеотидный праймер, комплементарный сегменту вставки, отстоящему примерно на 300 нуклеотидов от места связывания первого праймера, и секвенируют следующие 250-350 нуклеотидов. Аналогичным образом синтезируют третий праймер и определяют нуклеотидную последовательность следующих 250—350 нуклеотидов (рис. 5.17). Эту процедуру, называемую праймер-опосредованной прогулкой, продолжают до тех пор, пока не секвенируют весь фрагмент. Аналогичным образом секвенируют вторую цепь, начиная с праймера, который гибридизуется с этой цепью вблизи вставки. [c.93]

Подбор второго праймера, комплементарного концевому участку уже секвениро-ванной последовательности длиной примерно 20 нуклеотидов. 4. Секвенирование следующего сегмента клонированной ДНК с помощью второго праймера (Р2). 5. Подбор третьего праймера, комплементарного концевому участку этого сегмента размером 20 нуклеотидов. 6. Третий праймер (РЗ) используется для секвенирования следующего сегмента клонированной ДНК. Эту процедуру продолжают до тех пор, пока не будет секвенирована вся вставка. [c.94]

Для определения нуклеотидной последовательности протяженных клонированных сегментов сначала подбирают синтетический олигонуклеотидный праймер, комплементарный участку, соседствующему со вставкой, и с помощью диде-зокси-метода секвенируют первые 250-300 нуклеотидов. Затем по результатам секвенирования синтезируют второй праймер и определяют последовательность следующих 250-350 нуклеоти- [c.103]

Праймер-опосредованная прогулка ( блуждающая затравка ) (Primer walking) Один из методов секвенирования протяженных сегментов ДНК (>1 т.п.н.) с использованием праймера (затравки), комплементарного концу уже известной последовательности. На основании данных, полученных на первом этапе, синтезируют новый праймер, перекрывающийся с концом уже секвенированного участка, и используют его для определения нуклеотидной последовательности следующего участка клонированной ДНК. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не секвенируют весь сегмент. [c.545]

Для завершения картирования необходимы были выводы, основанные на размере РНК-белка. Однако не было получено подтверждающих данных ни при исследовании трансляции мРНК in vitro 95], ни при олигонуклеотидном картировании изолированных сегментов РНК [138], ни при пептидном картировании белков или при секвенировании РНК (обзор этих материалов см. в работе [132]), когда достаточная консервативность структуры позволяет легко идентифицировать ген или продукт гена как М, NP или NS. Окончательные доказательства были получены только после изучения генного клонирования и экспрессии (см. главу 6). [c.19]

Последние опыты показали, что сегмент 8 РНК кодирует по крайней мере два неструктурных полипептида — NS1 и NS2, которые транслируются с отдельных мРИК [48, 55, 85]. Картирование и секвенирование показали, что NS1 и NS2 перекрываются 70 аминокислотами, которые транслируются с различных рамок считывания. Полипептиды NS1 и NS2 разделяют между собой девять аминокислот иа их N-концах, но после этой последовательности мРНК для NS2 имеет делецию из 423 нуклеотидов. Затем остальная мРНК вновь объединяется в -Ь1 рамке считывания. Функция NS1 или NS2 еще не установлена. NS1 производится в больших количествах и накапливается в ядре [65] NS2 производится в последней стадии инфекции и обнарун ивается в основном в цитоплазме [55, 67]. [c.154]

Третий сегмент РНК кодирует кислый полипептид РА, имеющий у вируса PR8 м.м. 82 400 [61]. На основании данных секвенирования [25 J. Robertson, I. Roditi, в печати] и двухмерного электрофореза в ПААГ с неуравновешенным pH и градиентом SDS [98, 100] -считают, что продукт сегмента 3 является кислым белком у всех изученных штаммов вируса гриппа А и В. [c.219]

Смотреть страницы где упоминается термин Секвенирование сегментов РНК: [c.6] [c.105] [c.105] [c.108] [c.6] [c.105] [c.105] [c.30] [c.117] [c.39] [c.40] [c.41] [c.51] [c.53] [c.56] [c.105] [c.108] [c.111] [c.175] [c.281] [c.39] [c.40] [c.41] [c.51] [c.53]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология