Пикорнавирусы очистка

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЧИСТКА ПИКОРНАВИРУСОВ [c.44]

Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов Таблица 2.1. Классификация пикорнавирусов [c.45]

Настоящая глава состоит из четырех разделов, в которых рассматриваются необходимые меры безопасности, методы культивирования, идентификации и очистки пикорнавирусов. В качестве типичного представителя пикорнавирусов в ходе изложения будет рассматриваться полиовирус типа 3, так как именно он был основным объектом исследований, проведенных в лаборатории автора другие вирусы будут привлекаться для обсуждения по мере необходимости. [c.45]

Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов [c.47]

Выбранную культуру клеток можно выращивать на поверхности культурального флакона в стационарных условиях или в роллерной установке (в последнем случае используют бутылки и пробирки), а также в суспензии при осторожном перемешивании. Клетки наращивают до монослоя или высевают с нужной плотностью из трипсинизированной культуры за сутки до использования (хотя следует помнить о чувствительности рецепторов пикорнавирусов к протеазам [12]). В нашей лаборатории оказалось наиболее удобным использовать для получения небольших количеств (до 100 мкг) полиовируса вращающиеся пробирки, поскольку в них значительное количество клеток (Ю клеток на площади 66 см ) покрывается небольшим объемом среды (1 мл), что обеспечивает экономный расход радиоактивных соединений и позволяет получить препарат вируса, не требующий концентрирования перед очисткой. Культивирование полиовируса в роллерных установках обычно дает такой же выход и удельную радиоактивность, как и выращивание в монослое на флаконах при одинаковых концентрациях клеток, вируса и радиоактивного предшественника. Риновирусы, однако, предпочтительнее выращивать в роллерных культурах, поскольку для их репродукции нужны хорошая аэрация и слабокислый pH, хотя сами вирионы в кислой среде лабильны. [c.48]

Препараты пикорнавирусов, полученные из культур тканей, контаминированы клеточными компонентами, в том числе мембранами, и если вирус предполагается использовать для антигенного или биохимического анализа, его необходимо очистить. При этом, как правило, используют тот или иной метод центрифугирования в градиенте плотности. Если работа ведется со значительными количествами вируса, очистке обычно предшествует концентрирование, например осаждение вируса сульфатом [c.57]

Обычно пикорнавирусы очищают центрифугированием в градиенте плотности (хотя применялась и гель-фильтрация, в том числе в промышленных масштабах), В связи с малыми размерами пикорнавирусы имеют коэффициент седиментации 150— 160 5, меньший, чем у большинства других вирусов. Однако благодаря отсутствию липидов и исключительно компактной структуре они имеют высокую плавучую плотность (около 1,34 г/см в градиенте плотности хлористого цезия однако см. ниже разд. 5.3.3). В градиентах концентрации сахарозы такая плотность не достигается. Поэтому при очистке применяется разделение в сахарозных градиентах по скорости седиментации или разделение по плавучей плотности в градиентах хлорида или сульфата цезия. [c.59]

Очистка пикорнавирусов с использованием градиентов концентрации сахарозы [c.61]

Данный метод очистки пикорнавирусов в градиентах концентрации сахарозы не требует много времени и существенных материальных затрат и мало сказывается на свойствах вирусов (см. ниже). Однако при этом препараты вирусов могут содержать некоторые контаминанты. Если требуется исключительно высокая степень очистки, может возникнуть необходимость в дополнительном центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия. Как правило, это необязательно можно осадить вирус для удаления сахарозы (разд. 5.2.3). [c.61]

Очистка пикорнавирусов центрифугированием в градиентах плотности хлористого цезия [c.61]

Стимулом к изучению молекулярной биологии пикорнавирусов послужило обнаружение у полиовируса способности к размножению в культивируемых клетках [92]. Этому изучению способствовало также создание метода бляшек для определения инфекционности [82] и методов очистки и кристаллизации полиовируса [280, 292], сделавших возможным применение рентгеноструктурного анализа в этой области. Существенным моментом послужило и установление питательных потребностей [c.190]

Эффективность образования бляшек пикорнавирусами обычно довольно низка она составляет 0,1—2%, даже когда предпринимаются меры для удаления дефектных или инактивированных частиц [147, 161, 206, 243, 285]. Потеря инфекционности обычно связана с тепловыми повреждениями (например, с денатурацией вирионных белков), окислением тиоловых и метио-ниновых остатков, потерей УР4 или фрагментацией РНК в сердцевине. Все эти эффекты можно уменьшить, если собирать урожай вируса сразу после того, как его титр достигнет максимума (см., например, рис. 18.7), и производить очистку при нейтральном pH и низкой температуре. Чтобы минимизировать окисление или замещение реакционноспособных боковых групп [c.206]

Реовирусы термостабильны, устойчивы в пределах pH 2,2—8,0, устойчивы при обработке липидными растворителями. Липиды в них не обнаружены. Методы очистки peo-вирусов подобны методам очистки пикорнавирусов, исключая метод спиртовой преципитации. [c.7]

Хотя сами по себе вирионы пикорнавирусов не содержат липидов, в клеточных фракциях они часто связаны с мембранами, и для разрушения этой связи обычно применяют детергент в концентрации 17о. Если не удалить клеточные мембраны, то на следующих стадиях очистки не удается освободить вирус от примесей. Использовались самые разные детергенты, начиная с мягкого неионного детергента нонидета Р-40 (N1 -40) и кончая ДД -Na или саркозилом. По-видимому, наиболее разумно использовать мягкие детергенты, так как пустые капсиды и вирионы некоторых вирусов (например, определенных штаммов полиовируса типа 3) могут разрушаться более сильно действующими агентами. Мы, как правило, используем 1%-ный НР-40. [c.59]

Подобно большинству других РНК, выполняющих функцию мРНК, геном пикорнавирусов содержит на З -конце участок poly (А) варьирующей длины. Эта вариабельность сохраняется и после очистки вируса клонированием из бляшки (негативной колонии). Тем не менее средний размер варьирующего участка генетически обусловлен и изменяется от 35 для вируса ЕМС до 100 у афтовирусов (табл. 18.3). [c.195]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология