Градиент концентрации сахарозы

Таблица 1.2. Зональное центрифугирование в градиентах концентрации сахарозы

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Рис. И. Электрофорез растворимой рибонуклеиновой кислоты (около 0,5 жг), меченной радиоактивным фосфором Р , в градиенте концентрации сахарозы (0,03 М натрий-ацетатный буфер pH 4,8 4 ма, 2100 в 6 чае).

Седиментационные характеристики частиц, содержащихся в вирусных препаратах, можно исследовать либо методом зонального центрифугирования в градиентах концентрации сахарозы, либо методом аналитического ультрацентрифугирования. [c.24]

Обычно пикорнавирусы очищают центрифугированием в градиенте плотности (хотя применялась и гель-фильтрация, в том числе в промышленных масштабах), В связи с малыми размерами пикорнавирусы имеют коэффициент седиментации 150— 160 5, меньший, чем у большинства других вирусов. Однако благодаря отсутствию липидов и исключительно компактной структуре они имеют высокую плавучую плотность (около 1,34 г/см в градиенте плотности хлористого цезия однако см. ниже разд. 5.3.3). В градиентах концентрации сахарозы такая плотность не достигается. Поэтому при очистке применяется разделение в сахарозных градиентах по скорости седиментации или разделение по плавучей плотности в градиентах хлорида или сульфата цезия. [c.59]

В последние годы исследование проблем вирусного онкогенеза носит очень интенсивный характер, поскольку ученые надеются получить при этом ценную информацию о канцерогенезе у человека. Биологическая сложность этого явления ставит исследователя в очень трудное положение. Тот факт, что большинство онкогенных вирусов никогда не достигает высокой концентрации и что многие из них в ходе онкогенеза утрачивают свою целостность, делает эти вирусы трудно доступным объектом для биохимического исследования. До сих пор излюбленными методами исследователей, занятых изучением онкогенных вирусов, были иммунологические методы. Однако появившаяся недавно возможность метить вирусы радиоактивными атомами открыла новое поле для применения методов молекулярной биологии, таких, как фракционирование центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы и гибридизация. [c.266]

Чаще всего разделяемую смесь наносят на раствор сахарозы, который приготовлен таким образом, что уже в верхнем слое его плотность выше, чем плотность наносимого образца (иначе произошло бы практически мгновенное перемешивание), и постепенно возрастает в направлении к дну пробирки. Наличие градиента концентрации сахарозы существенно ослабляет диффузионное размывание зон, так как если по ходу перемещения зоны какого-либо биополимера часть его в результате диффузии опережает движение основной зоны, то она попадает в область с более высокой плотностью растворителя ро и в соответствии с (7.3) их перемещение затормаживается, а в случае их диффузии в сторону отверстия пробирки по той же причине их движение ускоряется. В обоих случаях частицы, ушедшие из <своей> зоны в результате диффузии, отбрасываются обратно. [c.243]

При электрофорезе в крахмале зоны размываются гораздо меньше, чем при последующем вытеснении (в целлюлозных колонках это различие не так заметно). Чтобы избежать излишнего расширения, стараются уменьшить по возможности длину участка, пройденного зоной при вытеснении. В пределе можно совсем избежать вытеснения, предусмотрев специальное устройство, позволяющее собирать зоны, дождавшись их выхода из колонки в свободный раствор. Можно, например, поместить полупроницаемую мембрану на небольшом расстоянии от поверхности набивки и с помощью насоса медленно промывать узкое пространство между набивкой и мембраной, собирая фракции. Если промывку вести достаточно медленно, можно значительно увеличить концентрацию в зонах элюируемых белков, так как последние будут накапливаться перед мембраной. Если применяются полупроницаемые мембраны, не следует забывать об изменении концентрации солей и pH, которое может возникнуть из-за неодинаковой проницаемости мембраны для ионов разного знака. Этот эффект аналогичен описанному выше явлению, вызванному резким изменением вязкости раствора (градиентом концентрации сахарозы). Чтобы избежать осложнений, можно поместить специальную компенсационную камеру за мембраной [29]. [c.90]

Вирус мозаики люцерны состоит из продолговатых, но, видимо, неспирализованных частиц диаметром 18 нм и длиной 36, 42 и 54 нм. С помощью электронного микроскопа [161], а также при центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы [266] можно обнаружить три или четыре типа частиц этого вируса. Установлено, что два компонента, выделенных из этого вируса в чистом виде и названных нижним компонентом и верхним компонентом а , содержат различные РНК, количества которых примерно пропорциональны размерам частиц [523]. Нижний компонент инфекционен, а верхний компонент не проявляет никакой инфекционности. Однако при объединении двух компонентов инфекционность резко повышается. [c.164]

Индивидуальные рРНК в препаративных кол-вах получают из изолнр. субчастиц рибосом или ультрацентрифугированием суммарной РНК в градиенте концентрации сахарозы. Для аналит. целей индивидуальные рРНК м.б. получены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. [c.266]

Как показано на рис. 29.5, это наблюдение коррелирует со свойствами отдельных нуклеосом. Анализ выделенных частиц представлен в верхней части рисунка. Препарат нуклеосом был расфракционирован на мономеры, димеры, тримеры и т.д. методом седиментации в градиенте концентрации сахарозы. Затем очищали ДНК из каждой фракции и анализировали с помощью электрофореза в акриламидном геле. [c.361]

Пробирка с градиентом концентрации сахарозы [c.42]

Важно воспроизвести препаративную реакцию точна при найденных условиях. Из-за больших объемов, вероятно, понадобится заранее нагреть раствор ДНК до нужной температуры. Рассчитайте объем фермента, требующийся для реакции. Не меняйте концентрации буфера, фермента или ДНК, Постарайтесь получить как можно больше расщепленной ДНК потребуется 200—300 мкг для очистки в градиенте концентрации сахарозы (разд, 2.2.3). [c.46]

Очистка фракции 30—50 т. п. н. частичного гидролизата в градиенте концентрации сахарозы [c.46]

Частицы рибонуклеопротеидов разделяют методом электрофореза в градиенте концентрации сахарозы [764, 1273], а ДНП-частицы — на полосках ацетата целлюлозы [705]. [c.393]

При выделении вирусов из таких тканевых экстрактов наилучшие результаты дают следующие методы а) дифференциальное центрифугирование б) осаждение сульфатом аммония в) центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы г) центрифугирование в градиенте плотности СвС д) экстракция растворителями и нротиво-точное распределение между частицами растворенного полимера и е) обработка ферментами [469, 470]. [c.35]

Обычно применяют градиенты концентрации сахарозы, растворенной в буфере, который использовался для очистки вируса. Не следует использовать для приготовления сахарозных градиентов боратные буферы. При очистке большинства простых (т. е. состоящих только из белковой оболочки и нуклеиновой кислоты) вирусов применяют 10—40%-ные сахарозные градиенты. Их можно приготовить одним из следующих способов [c.16]

Б. Примерное время центрифугирования разных вирусов в градиентах концентрации сахарозы ) [c.17]

Получение рибосом из печени крысы. Навеску ткани гомогенизируют (приготовление препарата см. на с. 49) в гомогенизаторе Поттера в 5-кратном объеме среды выделения следующего состава 0,01 М трис-буфер (pH 7,6), 0,02 М Mg la и 0,05 М сахароза. Гомогенат центрифугируют на холоде при 18 000 в течение 30 мин. Центрифугат сливают в колбу, осадок суспендируют в таком же объеме среды выделения и повторяют гомогенизацию. Гомогенат центрифугируют, осадок отбрасывают, а центрифугат объединяют с первым. Объединенный раствор подвергают ультрацентрифугированию при 105000 g в течение 90 мин. Осадок рибосом суспендируют в среде, содержащей 0,1 М трис-буфер и 0,001 М Mg la. Если суспензия мутная, ее осветляют центрифугированием на хоМде (18000 g, 15 мин). Очистка фракции рибосом может быть проведена также ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы 10—30% (с. 172). [c.170]

Для наблюдения скорости диффузиофореза были поставлены опыты [4], схема которых показана на рис. Х.7. Втцубке С С высотой около 10 см создавался вертикальный градиент концентрации сахарозы (или глюкозы), для чего нижний конец трубки сообщался с большим резервуаром В, содержавшим высокую концентрацию сахарозы, а верхний конец — с чистым растворителем в резервуаре А. Растворителем служила смесь воды и метилового спирта такой концентрации, при которой ее плотность была равна 0,97 г/см . В среднюю часть трубки помещались шарики японского воска с плотностью <3,945 г/см и радиусами от 0,1 до 1,5 мм. Вначале, когда весь перепад концентрации сахара был сосредоточен в узкой средней зоне трубки, все шарики независимо от радиуса были сосредоточены на почти одинаковой высоте в этой же зоне. По мере того как шла диффузия и зона переходных концентраций размывалась, устанавливалось определенное распределение шариков по высоте в зависимости ют их радиусов. [c.306]

Очистка пикорнавирусов с использованием градиентов концентрации сахарозы [c.61]

Данный метод очистки пикорнавирусов в градиентах концентрации сахарозы не требует много времени и существенных материальных затрат и мало сказывается на свойствах вирусов (см. ниже). Однако при этом препараты вирусов могут содержать некоторые контаминанты. Если требуется исключительно высокая степень очистки, может возникнуть необходимость в дополнительном центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия. Как правило, это необязательно можно осадить вирус для удаления сахарозы (разд. 5.2.3). [c.61]

Отводную трубку опускают в цептрифужную пробирку и прислоняют к внутренней стенке так, чтобы эта трубка все время находилась чуть выше уровня раствора, наполняющего эту пробирку. Поскольку в ходе формирования градиента концентрация сахарозы в растворе постепенно снижается, то в пробирке мепее концентрироваиный раствор наслаивается на слои более концентрированного раствора таким образом формируется непрерывный градиент плотности. Если С] орость вытекания жидкости из смесителя достаточно мала, то существенного перемешивания раствора сахарозы в центрифужной пробирке пе происходит. Насколько мне известно, оптимальная скорость наполнения пробирки сахарозным градиентом еще не установлена, однако принято считать, что продолжительность нриготовления одного градиента составляет 10—15 мин. Если экспериментатор пон елает проверить свой собственный метод приготовления градиента, то ему потребуется только расфракционировать градиент так, как это будет описано далее, и определить коэффициент преломления каждой фракции. [c.129]

Это уравнение приводит полученные данные к температуре и вязкости воды при 20° С. Однако при использовании градиента концентрации сахарозы плотность р и вязкость т] меняются в радиальном направлении. Если можно считать, что осмотические явления отсутствуют и что форма и размер частиц от концентрации сахарозы не зависят, то значение го, и можно получить, рещая уравнение (IX.4). При этом использование изокинети-ческого градиента упрощает расчеты. Нолль [1] подробно описывает методику получения таких градиентов и приводит ряд соответствующих таблиц для различных типов препаративных роторов. [c.178]

Аппарат фирмы LKB объемом 110 мл [104] линейный градиент концентрации сахарозы в 1%-ном растворе амфолина LKB, pH 5—8 в присутствии б М мочевины образец — 25 мг обессоленного препарата в 56 мл раствора, не содержащего сахарозы условия разделения 2 ч при 500 В и 48 ч при 800 В начальный ток 2,8 мА, конечный — 1,8 мА температура —20 °С, объем отбираемых фракций — примерно 30 капель. У — изоэлектри-ческие точки фракций с максимумом поглощения при 280 нм 2 —градиент pH. [c.322]

Рис. 4-43. Образец субклеточных компонентов наносят поверх разведенного субклеточного раствора сахарозы и осаждают при различных скоростях в зависимости от размера. В пробирке устанавливается непрерывный градиент плотности сахарозы, концентрация которого возрастает в направлении дна пробирки (обычно используют концентрацию сахарозы в пределах 5-20%). Градиент концентрации сахарозы необходим для стабилизации раствора и седиментируюших полос в условиях конвекции. После центрифугирования различные компоненты можно, как правило, собрать в отдельности. Для этого пластмассовую центрифужную пробирку прокалывают и собирают капли со дна, как это показано на рисунке.

В 1961 г. в журнале Nature были опубликованы работы двух групп авторов, сыгравшие исключительную роль в формировании современных представлений о процессах биосинтеза белка. В обоих случаях было использовано препаративное ультрацентрифугирование в одном из них компоненты бесклеточнои системы разделяли в градиенте плотности хлористого цезия, в другом использовали градиенты концентрации сахарозы. [c.8]

В последнее время для зонального ультрацентрифугирования стали применять угловые роторы, обладающие, как оказалось, некоторыми преимуществами перед роторами с подвесными стаканами. Известный недостаток угловых роторов, связанный с происходящей в них конвекцией, компенсируется применением градиента концентрации сахарозы. В работе Фламма с сотр. [12] описано применение такого ротора для разделения и фракционирования отдельных цепей ДНК при помощи изопикнического ультрацентрифугирования. Направление градиента плотности в пробирке углового ротора после его остановки изменяется на 90°, что, очевидно, эквивалентно соответствующему изменению ориентации пробирки в подвесных стаканах [13]. В угловых роторах, как правило, используются пробирки относительно большего объема, и число пробирок в угловом роторе также больше, чем в роторе с подвесным стаканом. Толщина слоя жидкости с градиентом плотности в этом случае меньше, что уменьшает время достижения равновесия. В работе [12] исследовано зональное фракционирование нуклеиновых кислот. РНК в использованных авторами этой работы условиях быстро седиментирует и оседает на стенке пробирки, в то время как ДНК хорошо разделяется в градиенте плотности. На фиг. 39 иллюстрируется улучшение разрешения за счет применения углового ротора. [c.185]

Лучший метод изолирования ИРНК, найденный до сих пор, — ультрацентрифугирование рибосомного препарата при достаточно низкой концентрации (<10 М) ионов Mg . Для того чтобы провести ультрацентрифугнрование заметного количества вещества, оно осуществляется в нренаративном роторе (с шарнирно подвешенными стаканчиками) в течение 5—6 ч. В пробирке предварительно создается с помощью специального дозатора градиент концентрации сахарозы от 25% у дна до 5% вверху. На поверхность жидкости наслаивается 0,2 мл центрифугируемой взвеси. Вследствие градиента плотности не происходит конвекционного перемешивания, и разделение компонентов осу- [c.468]

Одним из самых простых и широко распространенных методов фракционирования нуклеиновых кислот и других макромолекул является центрифугирование в сахарозном градиенте. Раствор с градиентом копцентрации сахарозы служит одновременно песуш,ей и стабилизуруюш ей средой, через которую движутся макромолекулы под действием центробежной силы. 1)лагодаря наличию непрерывного градиента концентрации сахарозы возможность перемешивания компонентов при встряхивании и других механических воздействиях сводится к минимуму. Этому способствует также и довольно высокая вязкость растворов сахарозы. Поэтому прп центрифугировании в сахарозном градиепте можно добиться значительно лучшего разделения смеси, чем при центрифугировании в обычном буфере. [c.127]

Сахароза. Для разделения РНК чаще всего используют градиенты концентрации сахарозы от 15 до 30% или от 5 до 20% имеются сведения об использовании также и других сахарозных градиентов, например градиентов концентрации от 10 до 40% сахарозы. По-видимому, оптимальная разница концентраций сахарозы в градиенте может варьировать в зависимости от природы разделяемой РНК и цели опыта. В нашей лаборатории мы обычно используем градиенты от 15 до 30% сахарозы. В этих градиентах оба вида рибосомных РНК разделяются несколько лучше, чем в градиентах от 5 до 20% сахарозы. Время центрифугирования, необходимое для максимального разделения 18S- и 28S-PHK (мы обычно работаем на роторе SW25 при 25 ООО об1мин и температуре 0—5°), составляет 17—18 час. Это означает, что центрифугирование можно начать довольно поздно во второй половине дня и закончить утром следующего дня. [c.130]

Поскольку мы получили удовлетворительное уравнение, связывающее молекулярный вес РНК с ее характеристической вязкостью и константой седиментации, было бы желательным располагать надежными уравнениями, связываюпщми молекулярный вес с канодым из этих параметров в отдельности. Хотя несколько подобных уравнений и опубликовано в литературе, они были выведены на основании изучения какого-то одного типа РНК в определенном растворителе и, строго говоря, применимы только для той же РНК в том же растворителе. Это связано с тем, что конформация РНК меняется с изменением температуры и ионной силы раствора. Поэтому не может быть универсального уравнения, связывающего константу седиментации РНК с ее молекулярным весом, и прямого способа расчета молекулярного веса по константам седиментации, обычно получаемым из данных седиментации в градиенте концентрации сахарозы. Чтобы проиллюстрировать, каким образом могут различаться [c.260]

С этой точки зрения даже наиболее высокоочищенные препараты вирусов можно рассматривать как статистически гомогенные лишь в первом приближении. Тем не менее, прежде чем использовать препарат вируса для физико-химических, биохимических или биологических экспериментов, важно установить, по возможности более тщательно, степень этой гомогенности или гетерогенности. Большинство методов очистки вирусов можно использовать также и для определения гомогенности вируса. Если при равделении в градиенте концентраций сахарозы вирус образует одну-едииственную резко ограниченную полосу, можно считать, что по седиментационным свойствам исследуемый препарат более или менее гомогенен. Однако если очистку вируса проводят только путем повторных циклов градиентного центрифугирования в растворе сахарозы, каждый раз удаляя материал, седиментирующий быстрее или медленнее, чем вирус, то в этом случае равномерность скорости седиментации уже не может служить показателем гомогенности. Иными словами, только сочетая при очистке и (или) проверке на гомогенность самые разнообразные методы, основанные на разных принципах, можно быть уверенным, что мы действительно имеем дело с каким-то определенным типом гомогенных частиц. К таким разнообразным критериям относятся константа седиментации, [c.47]

На самом деле существуют две кольцевые формы внутриклеточной ДНК фага К. Материал, седиментирующий в градиенте концентрации сахарозы почти вдвое быстрее, чем линейная ДНК фага %, оказался суперспирализован-ной ДНК. Материал же, седиментирующий в 1,14 раза быстрее, был нескрученной кольцевой ДНК, одна из цепей которой оставалась замкнутой (ковалентной связью). Последнее заключение было сделано на основании того, что при нагревании эта форма не превращалась в линейную [43, 352]. [c.121]

Был описан еще один очень простой метод ИЭФ [709]. Стеклянные трубки с внутренним диаметром 0,6 см и длиной 20 см закрывают снизу диализной мембраной, заполняют раствором с градиентом концентрации сахарозы (40—10%), содержащим 1% амфолина, и помещают в аппарат для диок-элект-рофореза. Фокусирование заканчивается через 5—6 ч, после чего на верхнюю часть каждой трубки надевают конический тефлоновый колпачок, через который полученные фракции вытесняются вверх в результате накачивания в трубку снизу какого-либо раствора с высокой плотностью. Естественно, что при использовании такой методики также мож1но одновременно изучать несколько различных препаратов. [c.135]

Другим надежным критерием для установления природы инфекционности служит определение скорости седиментации инфекционной фракции. Полные вирусы по своим размерам крупнее и седиментируют значительно быстрее, чем их нуклеиновые кислоты. Интактные молекулы нуклеиновых кислот имеют весьма характерные скорости седиментации в стандартных условиях ионной силы и т. д. Таким образом, определение инфекционности во всех фракциях, полученных при центрифугировании вирусной РНК в градиенте концентрации сахарозы, ясно показывает, связана ли инфекционность с компонентом типичной РНК (константа седиментации у многих вирусных РНК равна приблизительно 30S), седиментирует ли она подобно вирусу (константа седиментации обычно в пределах 60— 200S) или подобно комплексу, образовавшемуся между РНК и небольшим количеством белка. Существуют и такие методы дифференцирования вирусов и РНК, которые основаны на различиях их растворимости в молярных растворах солей [144, 162]. [c.178]

Каковы различия в принципах и применении между ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы, в градиенте плотности хлорида цезия и аналитическим центр ифугир ОБ анием [c.285]

Гетерогенность митохондриальной фракции привела де Дюва и других исследователей к необходимости разработки и использования для ее разделения центрифугирования в градиенте плотности i[1027]. Обычно центрифугирование проводят в градиенте концентрации сахарозы, хотя в растворах с высокой ее концентрацией и соответственно с высокой плотностью некоторые органеллы могут разрушаться. Используют также растворы с градиентом концентрации полисахаридов — высокомолекулярных соединений. С помощью этих методов удалось разделить митохондрии, лизосомы и пероксисомы и показать, что они содержат разные наборы ферментов. Эти органеллы не очень различаются по размеру (табл. 12.1) плотности указанных частиц из печени крысы в 0,25 М растворе сахарозы, примерно одинаковы и равны 1,100—1,103 для лизосом, 1,099 для митохондрий и 1,088—1,095 для пероксисом. Предварительная обработка животных препаратами, способными адсорбироваться клетками и накапливаться в лизосомах, приводит к уменьшению плотности этих органелл и при последующем выделении структур обеспечивает лучшее разделение их при центрифугировании. В настоящее время разработаны приемы, позволяющие разделять органеллы всех трех видов и получать их в больших количествах. [c.85]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология