Биотин конъюгаты с антителами

Предложено несколько способов дальнейшего повышения чувствительности ферментных меток. Например, в методе ELISA с усилением используют комплексы ферментов со специфическими антителами (Butler et al, 1985) в системе ЛВС применяют комплексы авидина с конъюгатом [биотин — фермент] и конъюгаты биотина с антителами (Hsu, 1985). [c.32]

Для этого метода предварительно синтезируют каким-либо химическим методом конъюгаты антител с биотином и фермента с авидином, а затем при простом смешивании реагентов — конъюгат. [c.191]

Достоинствами данного подхода являются универсальность конъюгата, используемого для анализа различных антигенов, и повышение чувствительности регистрации образуемого иммунохимического комплекса. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что при синтезе конъюгата антитело—биотин с одной молекулой антитела может быть ковалентно связано до 90 молекул биотина. Молекула авидина имеет четыре центра связывания биотина, поэтому каждый специфический иммунохимический комплекс с участием определяемых антител на конечной стадии анализа будет содержать не одну молекулу фермента, а несколько десятков, что приводит к существенному выигрышу в чувствительности определения метки, а следовательно, и всего анализа. [c.105]

В АБМ-методе авидин используется в роли мостика между двумя или более молекулами биотинсодержащего конъюгата типа [биотин — антитела] или [биотин — пероксидаза]. Этот метод основан на том, что авидин содержит четыре центра связывания биотина. Теоретически он должен характеризоваться более высокой чувствительностью, чем МАБ-метод, благодаря возможному усилению в системе взаимодействий биотин — авидин — биотин. Молекулы авидина, связывающиеся с конъюгатом-антитела — биотин], вообще говоря, могли бы связать еще [c.415]

Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5 -конец зонда X метят биотином, а З -конец зонда V — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было. [c.198]

Наличие разных моноклональных антител к одному и тому же продукту лежит в основе количественного иммунологического анализа белка методом сэндвича , когда одно антитело используется в качестве твердой фазы для связывания присутствующего в растворе антигена, а другое антитело используется в качестве меченого зонда для обнаружения иммобилизованного материала. Хотя мы работали как с зондами, меченными так и с зондами, меченными ферментативно активными конъюгатами (в последнем случае обычно к антителам присоединяли биотин и использовали конъюгат фермента с авиди-ном), здесь мы приводим описание только первой методики, поскольку в нашей практике она оказалась более удобной. Этот метод пригоден также и для выяснения следующего вопроса о том, конкурируют ли между собой антитела за взаимодействие со стерически тесно ассоциированными участками, а также для изучения белок-белковых взаимодействий. [c.197]

Биотин и авидин являются нефлуоресцирующими молекулами, которые обладают высоким сродством друг к другу. Они легко присоединяются к антителам и многим флуорохромам. Чаще всего биотин конъюгируют с антителами, а авидин — с флуорохромами. Обычно клетки сначала инкубируют с био-тинилированными антителами, а затем с конъюгатом флуоро-хром-авидин (как это делают при непрямом способе детектирования). С помощью этого метода можно выявлять антитела по флуоресценции разного цвета в зависимости от используемого для конъюгации с авидином флуорохрома. Более важным, однако, является то, что система авидин — биотин часто позволяет решить проблему мечения антител определенными флуорохромами. Поскольку биотин относительно легко конъюгирует с антителами, а авидин — с большинством флуорохромов, даже в тех случаях, когда не удается непосредственно присоединить флуорохром к антителам, их можно выявлять непрямым способом. [c.334]

Рис. 18-4. Антитела против ДНФ-лизина препятствуют связыванию конъюгата [ДНФ-лизин — -галак-тозидаза — биотин] с авидин-сефа-розой. К 200 мкл раствора конъюгата (1,36 нмоль) добавляли различные количества препарата ЦНФ-специфической антисыворотки. Объем смеси доводили до 600 мкл и добавляли фиксированные количества 10 /о-ной суспензии авидин-сефарозы (400 мкл). Инкубировали 30 мин при 25 °С и центрифугировали в течение 5 мин. В супернатантах (800 мкл) определяли ферментативную активность (светлые кружки). Осадки трижды промывали и определяли в них активность фермента (темные кружки), как описано для рис, 18-3,

Вещества, меченные биотином, могут быть обнаружены с помощью любого из используемых конъюгатов или комплексов авидина с тем или иным индикаторным реагентом типа авидин — флуоресцеин, авидин — ферритин или АБК- Таким образом, после того как вещество помечено биотином, для его обнаружения можно приспособить любую систему анализа. В то же время при использовании антител, меченных флуоресцеином или пероксидазой, круг их применения ограничен, т. е. авидин-биотиновая система характеризуется гораздо большей гибкостью, чем дру- [c.419]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология