Конъюгат с биотином

Рисунок 21. Определения малых количеств человеческой ДНК методом гибридизации биотинилированного олигонуклеотида с образцами иммобилизованной ДНК. Визуализация образовавшегося ассоциаты происходит путем связывания с биотином конъюгата Пероксидазы хрена со Стрептавидином и дальнейшего окисления хромогена ТМВ.

Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин — биотин, который образуется с 10 М-> по схеме [c.191]

Предложено несколько способов дальнейшего повышения чувствительности ферментных меток. Например, в методе ELISA с усилением используют комплексы ферментов со специфическими антителами (Butler et al, 1985) в системе ЛВС применяют комплексы авидина с конъюгатом [биотин — фермент] и конъюгаты биотина с антителами (Hsu, 1985). [c.32]

Модификация конъюгата [биотин — р-галактозидаза] [c.277]

Для этого метода предварительно синтезируют каким-либо химическим методом конъюгаты антител с биотином и фермента с авидином, а затем при простом смешивании реагентов — конъюгат. [c.191]

Получение конъюгата [ -галактозидаза — биотин] [c.277]

В литературе описан также гомогенный вариант ХИА с использованием конъюгатов биотин — изолюминол. При взаимодействии этого конъюгата с авидином в двух окислительных систе- [c.141]

Важное преимущество нового метода состоит в том, что одни и те же липосомы можно использовать с разными конъюгатами [цитолизин—определяемое вещество], в частности с конъюгатами [цитолизин—гаптен]. Действительно, липосомы,. которые применялись в описанных здесь опытах, были использованы также с конъюгатом [биотин—мелиттин] для определе- [c.127]

К одной молекуле пероксидазы можно присоединить большое количество биотиновых молекул. Поэтому одна молекула конъюгата [биотин — пероксидаза] может взаимодействовать с несколькими молекулами авидина. [c.417]

Меченные биотином иммуноглобулины и лектины весьма стабильны. Их реакционная способность остается неизменной при хранении в течение 3 лет при 4 С. То же верно и для авидина, и для конъюгата [биотин — пероксидаза]. Мы обычно готовим АБК непосредственно перед использованием для анализа тканевых срезов. Комплекс можно сохранять при 4 С не менее двух дней. Впрочем, систематического изучения стабильности комплекса мы не проводили. [c.420]

Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5 -конец зонда X метят биотином, а З -конец зонда V — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было. [c.198]

Наличие разных моноклональных антител к одному и тому же продукту лежит в основе количественного иммунологического анализа белка методом сэндвича , когда одно антитело используется в качестве твердой фазы для связывания присутствующего в растворе антигена, а другое антитело используется в качестве меченого зонда для обнаружения иммобилизованного материала. Хотя мы работали как с зондами, меченными так и с зондами, меченными ферментативно активными конъюгатами (в последнем случае обычно к антителам присоединяли биотин и использовали конъюгат фермента с авиди-ном), здесь мы приводим описание только первой методики, поскольку в нашей практике она оказалась более удобной. Этот метод пригоден также и для выяснения следующего вопроса о том, конкурируют ли между собой антитела за взаимодействие со стерически тесно ассоциированными участками, а также для изучения белок-белковых взаимодействий. [c.197]

Достоинствами данного подхода являются универсальность конъюгата, используемого для анализа различных антигенов, и повышение чувствительности регистрации образуемого иммунохимического комплекса. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что при синтезе конъюгата антитело—биотин с одной молекулой антитела может быть ковалентно связано до 90 молекул биотина. Молекула авидина имеет четыре центра связывания биотина, поэтому каждый специфический иммунохимический комплекс с участием определяемых антител на конечной стадии анализа будет содержать не одну молекулу фермента, а несколько десятков, что приводит к существенному выигрышу в чувствительности определения метки, а следовательно, и всего анализа. [c.105]

Биотин и авидин являются нефлуоресцирующими молекулами, которые обладают высоким сродством друг к другу. Они легко присоединяются к антителам и многим флуорохромам. Чаще всего биотин конъюгируют с антителами, а авидин — с флуорохромами. Обычно клетки сначала инкубируют с био-тинилированными антителами, а затем с конъюгатом флуоро-хром-авидин (как это делают при непрямом способе детектирования). С помощью этого метода можно выявлять антитела по флуоресценции разного цвета в зависимости от используемого для конъюгации с авидином флуорохрома. Более важным, однако, является то, что система авидин — биотин часто позволяет решить проблему мечения антител определенными флуорохромами. Поскольку биотин относительно легко конъюгирует с антителами, а авидин — с большинством флуорохромов, даже в тех случаях, когда не удается непосредственно присоединить флуорохром к антителам, их можно выявлять непрямым способом. [c.334]

Была предпринята попытка использования в той же схеме анализа другой комбинации реагентов (Burd et al., 1977). Флуо-рофором служил умбеллиферон (или флуоресцеин). Ковалентно присоединив его к биотину (или 2,4-динитрофенильному производному биотина) через сложноэфирную связь, получили нефлуоресцирующий конъюгат. Сложноэфирную связь расщепляли при помощи свиной эстеразы. Связывание с авидином (или с [c.168]

Рис. 18-3, Связывание конъюгата [ДНФ-пизин — -галактозидаза — биотин] с ави-дин-сефарозой. К 200 мкл раствора конъюгата (1,36 нмоль) добавляли различные количества 10%-ной суспензии сорбента. Доводили объем смеси до 600 мкл 0,5%-ным раствором желатины в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,2, инкубировали 30 мин при 25 С и центрифугировали 5 мин на микроцентрифуге Эппендорф . В надосадочной жидкости (500 мкл) определяли активность -галактозидазы по расщеплению хромогенного субстрата о-нитрофенил- -ra-лактопиранозида (светлые кружки). Осадки трижды промывали, суспендируя их в 1 мл 0,5%-ного раствора желатины, 0,1 М фосфатного буфера, pH 7,2, с последующим 5-минутным центрифугированием. Определяли ферментативную активность, суспендируя осадки в 3 мл раствора субстрата (темные кружки), Все ферментативные реакции проводили при 25 °С в течение 30 мин.

Рис. 18-4. Антитела против ДНФ-лизина препятствуют связыванию конъюгата [ДНФ-лизин — -галак-тозидаза — биотин] с авидин-сефа-розой. К 200 мкл раствора конъюгата (1,36 нмоль) добавляли различные количества препарата ЦНФ-специфической антисыворотки. Объем смеси доводили до 600 мкл и добавляли фиксированные количества 10 /о-ной суспензии авидин-сефарозы (400 мкл). Инкубировали 30 мин при 25 °С и центрифугировали в течение 5 мин. В супернатантах (800 мкл) определяли ферментативную активность (светлые кружки). Осадки трижды промывали и определяли в них активность фермента (темные кружки), как описано для рис, 18-3,

Рис. 18-5. Стандартная кривая для тестирования ДНФ-лизина с помощью метода ИФАЯМ. К 200 мкл раствора с фиксированным содер-жанием конъюгата [ДНФ-лизин — р-галактозндаза — биотин] (1,36 нмоль) добавляли по 100 мкл раствора с различным содержанием свободного ДНФ-лизина. К смесям добавляли по 0,5 мкл ДНФ-специфнческой антисыворот-кн и по 500 мкл 10%-ной суспензии авидин-сефарозы. Инкубировали 30 мин при 25 °С и центрифугировали 5 мин. В супернатантах (800 мкл) определяли активность фермента (светлые кружки). Осадки трижды промывали и определяли в них активность (темные кружки), как описано цля рис, 18-3,

В качестве якорных могут использоваться и молекулы, отличные от биотина, если доступны также соответствующие рецепторные молекулы, обладающие достаточно высоким сродством. Непревзойденным преимуществом использования системы биотин — авидин является необычайно высокое взаимное сродство ее компонентов (Green, 1975). В качестве якоря в состав конъюгатов [Л—Ф—Я] можно вводить и собственно авидин, а в роли своего рода молекулярного крюка для вылавливания таких конъюгатов использовать иммобилизованный биотин. [c.282]

Можно использовать одну из трех основных разновидностей системы авидин — биотин 1) меченый авидин — биотин (МАБ-метод), 2) авидин-биотиновый мостик (АБМ-метод) и 3) ави-дин-биотиновый комплекс (АБК-метод). В рамках МАБ-метода вещество, меченное биотином, непосредственно обнаруживают по взаимодействию с авидиновым конъюгатом типа [авидин — флуоресцеин] или [авидин — пероксидаза]. Хотя использование-авидин-пероксидазного конъюгата обеспечивает достаточно высокую чувствительность определения, следует отметить и существенный недостаток этого метода — высокий уровень фона и неспецифическое окрашивание тканей некоторых типов, в частности почечных тканей. [c.415]

В АБМ-методе авидин используется в роли мостика между двумя или более молекулами биотинсодержащего конъюгата типа [биотин — антитела] или [биотин — пероксидаза]. Этот метод основан на том, что авидин содержит четыре центра связывания биотина. Теоретически он должен характеризоваться более высокой чувствительностью, чем МАБ-метод, благодаря возможному усилению в системе взаимодействий биотин — авидин — биотин. Молекулы авидина, связывающиеся с конъюгатом-антитела — биотин], вообще говоря, могли бы связать еще [c.415]

С целью повысить чувствительность анализа мы разработали метод, основанный на применении комплекса [авидин — биотин — пероксидаза] (АБК-метод). Тот же принцип был положен в основу разработанных недавно вариантов АБК-метода с применением комплексов [авидин — биотин — щелочная фосфатаза] и [авидин — биотин — глюкозооксидаза]. Образование названных комплексов в АБК-методе обеспечивается следующими биохимическими характеристиками авидина и биотинсодержащих конъюгатов [c.417]

Авидин содержит четыре центра связывания биотина и соответствующих конъюгатов. Поэтому авидин может образовать мостик между по крайней мере двумя или более молекулами биотинсодержащего конъюгата. [c.417]

Вещества, меченные биотином, могут быть обнаружены с помощью любого из используемых конъюгатов или комплексов авидина с тем или иным индикаторным реагентом типа авидин — флуоресцеин, авидин — ферритин или АБК- Таким образом, после того как вещество помечено биотином, для его обнаружения можно приспособить любую систему анализа. В то же время при использовании антител, меченных флуоресцеином или пероксидазой, круг их применения ограничен, т. е. авидин-биотиновая система характеризуется гораздо большей гибкостью, чем дру- [c.419]

Смотреть страницы где упоминается термин Конъюгат с биотином: [c.127] [c.141] [c.416] [c.417] [c.223] [c.67] [c.258] [c.262] [c.688] [c.196] [c.189] [c.128] [c.192] [c.65] [c.69] [c.75] [c.333] [c.61] [c.66] [c.128] [c.278] [c.278] [c.221] [c.221] [c.223]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология