Антитела мечение ими молекул

Высокая специфичность антител по отношению к антигену делает их гибким и действенным инструментом, который можно использовать для выявления, количественного определения и локализации множества разнообразных веществ, представляющих интерес для биолога. Но как можно обнаружить или измерить взаимодействие антитела с антигеном Начальная реакция связывания антигена с антителом-так называемая первичная реакция-может быть измерена многими различными способами. При радиоиммунном анализе, позволяющем определять даже ничтожные количества материала, известное количество радиоактивного антигена вместе со стандартным количеством антител добавляют к образцу, содержащему неизвестное количество того же антигена в нерадиоактивной форме. Немеченый антиген конкурирует с меченым за связывающие участки антител, и чем больше данного антигена в образце, тем меньше радиоактивного антигена будет связано с антителом. Свободный радиоактивный антиген можно отделить от связанного, а затем измерить количество того и другого с помощью ряда методов, использующих различия в свойствах свободных и связанных молекул один нз общих подходов состоит в осаждении (преципитации) комплексов антиген-антитело антителами к иммуноглобулинам (рнс. 17-28). [c.27]

Существуют три основных методических подхода для решения этой задачи. Первый способ — избирательное окрашивание нейронов, выделяющих определенный нейромедиатор, может осуществляться с помощью преобразования естественного медиатора в его флуоресцирующее производное. В этом случае флуоресценция определенных групп клеток поможет выявить специфические связи в структурах мозга. Второй экспериментальный подход связан с введением молекул медиатора, предварительно меченного радиоактивным изотопом. Нейронные окончания, содержащие исследуемый медиатор, способны избирательно захватывать метку. Затем их легко выявить методом авторадиографии. Третий способ обнаружения специфических связей в нервной системе состоит в использовании высоко специфичной способности узнавать либо антигенные детерминанты медиатора, либо определенные ферментные белки, участвующие в метаболизме нейромедиаторов, либо нейрорецептор-ные компоненты на мембране клетки. Последние считаются наиболее убедительным свидетельством в пользу существования конкретных нейрохимических взаимодействий межцу клетками и зонами мозга. Обычно для иммунохимической идентификации используют флуоресцентный краситель или изотоп, который маркирует антитела. В последние годы широко распространились методы, использующие антитела, меченные частицами тяжелых металлов, например коллоидного золота, железа и др. [c.224]

Среди них наибольший интерес вызывают датчики на основе кислородного электрода. В качестве ферментных меток обычно применяют глюкозоксидазу или каталазу. На этом принципе, например, работает иммуноферментный амперометрический датчик для определения инсулина. Антитела инсулина иммобилизуют на капроновой сетке и закрепляют ее на поверхности кислородного электрода. При внесении электрода в анализируемый раствор антитела взаимодействуют с инсулином, к которому пришита глюкозоксидаза, с образованием комплексов АТ-инсулин-Е, где Е - фермент. Когда в растворе, наряду с меченым инсулином, присутствуют молекулы инсулина без фермента, то количество фермента на электроде будет тем меньше, чем выше концентрация инсулина. При внесении электрода в раствор глюкозы изменение величины тока будет соответствовать концентрации инсулина в анализируемом растворе. Кислородный электрод используется также для определения альбумина в сыворотке крови человека. Основные характеристики некоторых иммуноферментных электродов приведены в табл. 14.3. [c.506]

Значительно более прецизионный подход основан на титровании активных центров иммобилизованных антител меченым антигеном. В качестве метки целесообразно использовать низкомолекулярные соединения (изотоп, флуоресцирующий краситель, кофактор и т. д.), чтобы в максимальной степени снизить вероятность экранирования меткой антигенных детерминант. Суть метода заключается в насыщении микроколичеств иммуносорбента меченым антигеном. Получаемая в результате опыта изотерма адсорбции позволяет вычислять концентрацию и константы связывания иммобилизованных молекул антител. Так как в подобном эксперименте определяется не абсолютная концентрация активных центров антител, а концентрация центров, доступных для взаимодействия с антигеном, следует ожидать, что эта величина будет различной для антигенов с разными размерами и молекулярной массой. Например, при иммобилизации антител разной специфичности часть центров может экранироваться носителем от контакта с макромолекулярным антигеном, но быть доступной для низкомолекулярного. [c.218]

В клетке можно пометить любые молекулы для этого е них вводят один или несколько радиоактивных атомов. Нестабильные радиоактивные атомы распадаются, испуская излучение, что позволяет прослеживать судьбу исследуемых молекул. Применение радиоизотопов в клеточной биологии ограничено двумя видами экспериментов анализ метаболических путей по методу вытеснения метки и локализацией меченых молекул в клетке с помощью радиоавтографии. Антитела представляют собой очень удобный и чувствительный инструмент для локализации специфических биологических макромолекул В организме позвоночных животных продуцируются миллионы различных антител, в каждом из которых имеются участки связывания, опознающие специфические группы молекул. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью практически в неограниченных количествах. В принципе можно получать моноклональные антитела против любых макромолекул в клетке и затем использовать эти антитела для локализации или очистки определенных макромолекул, а в некоторых случаях и для анализа внутриклеточных свойств этих молекул. [c.228]

В связи с этим применение в анализе меченых антивидовых антител упрощает процедуру получения реагентов для анализа, так как позволяет, используя одни и те же конъюгаты, осуществлять определение разных антигенов и антител различной специфичности. Кроме того, чувствительность анализа ряда антигенов в этом случае может быть выше, чем при применении меченых специфических антител, вследствие возможности связывания не одной, а нескольких меченых молекул. Однако такой подход методически усложняет проведение анализа из-за введения дополнительных стадий инкубации и промывки носителя. [c.101]

Гомогенные методы, основанные на использовании меченых антител. Второй группой в гомогенном ИФА являются методы, основанные на использовании меченных молекулами ферментов антител. В противоположность первой, в которой все схемы относились к конкурентному типу, в данном случае анализ может быть и неконкурентным. [c.122]

Рис. 11-28. Электронная микрофотография фибробласта в культуре (окраска антителами, меченными коллоидным золотом). Видно, что организация белков в стрессовых волокнах напоминает мышечную. Показано расположение двух типов актин-связывающих белков а-актинин (крупные частицы золота) ассоциирован с периодически повторяющимися плотными участками в стрессовых волокнах (в поперечнополосатой мышце а -актинии находится в Z-дисках), тогдакак головки миозина (мелкие частицы золота) видны по обе стороны от полос с а-актинином. Такая организация имеет некоторое сходство с саркомером (сравните с рис. 11-2) и указывает на то, что молекулы миозина здесь собраны в филаменты.

При увеличении времени инкубации концентрация связанных меченых молекул сначала возрастает, а затем резко снижается. Эффект снижения может быть вызван тем, что продиссоциировав-ший из комплекса антиген связывается избытком меченых антител, что сдвигает равновесие в сторону дальнейшей диссоциации (отметим, что при выбранных начальных условиях степень заполнения антител антигеном на первой стадии близка к 100%. При меньших степенях заполнения эффект будет менее резко выражен). При данных условиях требуется строгая оптимизация длительности второй стадии анализа. Общей рекомендацией в подобном случае является уменьшение времени до при котором влияние процесса диссоциации будет незначительно. [c.249]

Возможность других способов представления ординаты зависит от методики анализа. Если при проведении ИФА используется меченый антиген, все молекулы которого обладают способностью взаимодействовать с антителами, то ордината графика может быть выражена в величинах, широко используемых в радиоиммунологическом анализе, а именно как процент связанной метки от начальной (или отношение концентрации связанной метки к свободной, свободной метки к связанной, связанной метки к исходной). Наиболее удобными для практических целей являются графики в двух первых координатах. Их форм-а сходна между собой и с графиками, приведенными на рис. 48. Однако в отличие от рис. 48 в этих случаях по оси ординат откладывается не экспериментальная, а расчетная величина и степень достоверности графика зависит от корректности расчета. Так, отношение концентраций связанного с антителами меченого антигена к свободным (В/Р) может быть получено двумя путями экспериментальным измерением Р и вычислением В по разности [Аг ]о—Р и, наоборот, экспериментальным измерением В и определением Р по разности [Аг ]о—В. [c.259]

Иная ситуация возникает, когда в ИФА применяют меченную ферментом глобулиновую или IgG-фракцию, содержание антител в которых точно неизвестно и может варьировать в довольно широких пределах. Как правило, более 80% меченых IgG в таких конъюгатах неспецифичны к определяемому антигену. В этих случаях возможна детекция только тех меченых молекул антител, которые в ходе анализа образовали специфический комплекс с антигеном на твердой фазе. На ординату калибровочного графика при этом наносят регистрируемый параметр, пропорциональной концентрации ферментной метки на носителе (например, о. е., о. е./мин и т. д.). [c.260]

Наряду с преимуществами РИА обладает и некоторыми недостатками. К ним относятся а) сравнительно короткий период полураспада изотопов, испускающих у-кванты б) опасность для здоровья, которую представляют введение изотопных меток, подготовка и выполнение анализов в) повреждение структуры меченых молекул, вызываемое излучением г) необходимость отделения меченых и немеченых антигенов, связавшихся с антителами, от свободных антигенов и д) обусловленная этим трудность автоматизации РИА. [c.10]

Радиоиммуноэлектрофорез. Если антиген или антитело пометить радиоактивным изотопом, то с помощью иммуноэлектрофореза можно анализировать чрезвычайно малые количества материала. Известно, что антигенные свойства IgQ не меняются, если молекула IgQ как антитело входит в иммунный комплекс. Если мы располагаем соответствующей иммунной сывороткой анти-IgQ, меченной радиоактивным изотопом, то с ее помощью мы можем выявлять IgQ в иммунных комплексах (например, в преципитатах). Радиоиммуноэлектрофорез состоит из следующих стадий [c.148]

Твердофазный РИА состоит из трех этапов а) адсорбция антител на поливиниловую поверхность пробирок б) связывание антигена из фекального экстракта фиксированными антителами в) определение адсорбировавшегося антигена с помош ью специфических, меченных радиоактивным иодом антител. Препарат меченых антител должен содержать 1 — 2 атома радиоактивного иода на 1 молекулу гамма-глобулина. [c.303]

Дальнейшим развитием этих идей является включение захватывающей молекулы в полоску в хроматографической системе. В большинстве систем, исполь- ющих этот вариант, захватывающую молекулу (например, антитело) иммо-били ют на хроматографическом носителе (бумага, кремнезем, полимер или гель и т. д.) и фиксируют в ввде полоски, так что проба (антиген), смешанная с меченым антигеном, коикуреитао реагирует за захват мест распознавания, по мере того как проходит по полоске. Несвязанный материал затем можно определить, так как он мигрирует за захватывающую полоску. Другой способ — оценка количества меченого антигена, захваченного в полоске. [c.580]

Хотя эксперименты, в которых в качестве индикаторов использовались меченные изотопами вещества, дали много ценных сведений относительно синтеза белка, тем не менее в этой области до сих пор еще остались нерешенными основные проблемы. На основании этих опытов невозможно решить, происходит ли непрерывное самообновление белков путем синтеза и последующего распада отдельных молекул белка или же оно обусловлено тем, что каждая из этих молекул, не распадаясь нацело, постоянно обменивает свои отдельные составные части. Подобный обмен может достигаться, например, путем временного размыкания пептидных связей и включения аминокислоты между концами раскрытых цепей. Для разрешения этой проблемы были использованы иммунологические методы. Как уже указывалось в гл. XIV, антитела находятся во фракции у глобулинов сыворотки. Если вызвать образование антител у кролика, иммунизируя его каким-либо антигеном, то вновь образованные иммунные т-глобулины можно отдифференцировать от f-глобулинов, присутствовавших до иммунизации, по их способности преципитировать соответствуюший антиген. Так, например, инъекция полисахарида пневмококков SIII приводит к образованию SIII-анти-тел во фракции глобулинов иммунной сыворотки. Если подопытным кроликам помимо антигена вводится N -глицин, то через небольшой промежуток времени меченая аминокислота обнару- [c.390]

Проблема получения высокочистых растворов радионуклидов приобрела особую актуальность при разработки технологии РФП на основе белков и пептидов. Это связано с ограниченным количеством координационных групп в молекуле белка или пептида, способных связывать радионуклид. Поэтому присутствие посторонних ионов в растворе, используемом для мечения, препятствует включению радионуклида в биомолекулу. Достаточно часто сегодня для подтверждения чистоты раствора исходного радионуклида используют пробную реакцию мечения пептида или антител, поскольку пока не имеется инструментальных методов анализа, способных идентифицировать примеси на требуемом уровне. [c.411]

Области применения аффинной хроматографии расширяются, поокольку метод основан на специфических взаимодействиях биологически активных веществ. Как видно из табл. 11.1, этот метод успешно используется при выделении самых разных соединений. Наряду с этим он полезен при изучении различных систем на аффинных сорбентах можно разделять низкомолекулярные энан-тиомеры и удалять нежелательные вещества из живых организмов. -Например, аффинной хроматографией можно разделить на оптические антиподы 0,Ь-триптофан. Используя специфическое выделение меченых пептидов, можно определить пептиды активного центра фермента, связывающего участка антител или участка пептидных цепей на поверхности молекулы. Аффинная хроматография может быть использована для изучения возможности замены природных пептидных цепей ферментов различными модифицированными синтетическими пептидами. Активные центры ферментов или антител, связывающие свойства субъединиц, специфичность ферментов по отношению к различным ингибиторам, комплементарность нуклеиновых кислот, взаимодействие нуклеотидов с пептидами, влияние присутствия различных соединений на образование специфических комплексов и т. д. могут быть исследованы с помощью аффинной хроматографии. [c.282]

Для того чтобы отличить сигнал от фона, а в некоторых случаях разделить сигналы связанного и несвязанного меченого антигена, можно использовать и другие молекулярные свойства. Нгшример, ксгда антиген мал, меченный флуоресцеином аналог способен вращаться с высокой скоростью, а комплекс с антителом имеет значительно меньшую скорость вращения. При возбуждении популяции флуоресцентных молекул линейно поляризованным светом, вероятность возбуждения любой отдельной молекулы определяется ее ориентацией. Если заморозить молекулу в опредэленном ноложении, так что вращения не происходит, то в результате наблюдают флуоресценцию в плоскостях поперечного электрического (ТЕ, ) и поперечного магнитного (ТМ, ) полей по отдельности, а максимальное значение поляризации Р ргшно 0,5 [c.590]

Агрегация молекул инсулина часто затрудняет его точную идентификацию при гель-хроматографии тем не менее в подходящем растворителе с помощью теля декстрана удалось, например, выделить кристаллический инсулин из одного экземпляра рыбы [37], из 10— 20 г поджелудочной железы быка [38] и из одной железы кошки [39]. Инсулин, меченный 1г (см., напри-Мер, [40]), служит для обнаружения взаимодействия антигена с антителом. Комплекс, образующийся в сыворотке, был отделен от свободного инсулина на сефадексе 0-75 [41]. С помощью хроматографии на сефадексе 0-200 было показано, что имеется по крайней мере две белковые фракции, с которыми связывается инсулин [42]. Ингибитор инсулина из альбуминовой фракции был частично очищен в препаративных масштабах [43]. С другой стороны, наблюдалось, что часть [c.216]

В ответ на попадание в организм чужеродных белков (антигенов) у животных синтезируются специфические к ним антитела. Белок-антитело, появляющийся в сыворотке крови, обладает способностью очень прочно, но обратимо связываться с молекулой антигена. Каждое антитело характеризуется высокой степенью специфичности и связывает только тот антиген, который стимулировал его выработку. Эти свойства антител, а именно их специфичность и сродство по отношению к своим антигенам были использованы Розалиндой Ялоу и ее коллегами для измерения крайне малых концентраций полипептидньк гормонов в крови и тканях. Суть метода состоит в следующем. Измеряемый гормон используют в качестве антигена (Аг) и вводят его морским свинкам. После нескольких инъекций у животных в плазме крови появляются антитела к введенному гормону, причем в достаточно высокой концентрации. Далее из сыворотки выделяют антитела (Ат) и смешивают их с известным количеством радиоактивно меченного гормона (Аг) при этом в результате обратимой реакции, равновесие которой сильно сдвинуто вправо, образуется комплекс антиген-антитело [c.784]

На основании этих данных можно было бы заключить, что обновление молекул сывороточных белков происходит не в результате кратковременного размыкания пептидных цепей и подключения к месту разрыва новых аминокислот, а путем полного распада отдельных белковых молекул с последующим образованием новых белковых частичек. Если, однако, вместо N -глицинa подопытным кроликам вводился С -лейцин, то наблюдалось включение меченой аминокислоты в 51-антитела [60]. Эти последние опыты с а У(инокислотой, меченной изотопным углеродом, представляются более убедительными, чем опыты с аминокислотой, меченной изотопным азотом, так как меченый азот может отщепляться и обмениваться в результате процессов дезаминирования и переаминирования. Тем не менее трудно предположить, что белковые молекулы антител могут подвергаться непрерывному обновлению своего аминокислотного состава и в то же время сохранять в неизменном виде свои свойства антител. Эти свойства, вероятнее всего, обусловлены тем, что форма поверхности молекулы антитела геометрически дополняет форму детерминирующей группы антигена. Трудно себе представить, каким образом может сохраняться эта дополнительная форма, если молекулы антитела непрерывно обменивают входящие в их состав аминокислоты на аминокислоты окружающей среды. [c.391]

Т летни, инфицированные вирусом, фиксировали и вслед за этим проводили реатпцио сначала со специфическим I этому вирусу антителом, а затем с меченным по ферритину антиглобулином. Молекулы ферритина отделены от вирусной частицы прос гранством, занятым специфическими антителами. [c.44]

Эту же технику использовали для изучения мембранных белков, не содержащих хромофоров. Вначале к таким белкам присоединяли флуоресцентные лиганды. Обычно для этой цели брали флуоресцентно меченные моновалентные антитела (т. е. фрагменты антител с одним участком связывания антигена и. следовательно, неспособных к сшиванию соседних молекул). Затем эти привязанные лиганды обесцвечивали лазерным лучом, после чего измеряли время, необходимое для того, чтобы мембранные белки, несущие необесцвеченные антитела, переместились путем диффузии в обесцвеченную область (рис. 6-35). Измеренные таким образом скорости диффузии различных гликопротеинов плазматической мембраны обычно оказывались по крайней мере в 5-50 раз меньше, чем у молекул родопсина. Относительно низкие скорости диффузии не являются свойством, внутренне присущим иидивидуаль- [c.374]

Рис. 9-89. Иммуно флуоресцентное мечение ядра фибробласта человека моноклональными антителами к мяРНП-частицам. участвующим в сплайсинге молекул-предшественников мРНК. Частицы мяРНП образуют большие агрегаты, которые могут функционировать как островки сплайсинга . Антитела выявляют определенные белки, присутствующие в ряде мяРНК и участвующие в работе сплайсосомы. (С любезного

Стабильность иммуноферментных конъюгатов при хранении— важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако вь1сокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет. Стабильность при хранении в растворе (+4°С) более года отмечена для конъюгатов с щелочной фосфатазой, р-галактозидазой, лизоцимом, пероксидазой. [c.113]

Однако чувствительность одностадийной схемы ниже чем двухстадийной, а контакт фермента с анализируемой средой может неблагоприятно отражаться на результатах анализа. Данная схема налагает также дополнительные требования на соотношение концентраций меченых и иммобилизованных антител с целью исключения их конкуренции за связывание с ограниченным числом антигенных детерминант на молекуле антигена. В этой связи целесообразным является использование в-анализе моноклональных антител, специфичных к различным антигенным детерминантам на мдлекуле антигена. Следует подчеркнуть, что данный метод анализа не может быть отнесен к конкурентному типу, так как формирование комплекса антигена с мечеными иди иммобилизованными антителами не [c.88]

Смотреть страницы где упоминается термин Антитела мечение ими молекул: [c.272] [c.216] [c.210] [c.118] [c.392] [c.151] [c.224] [c.224] [c.7] [c.299] [c.595] [c.261] [c.57] [c.338] [c.194] [c.224] [c.225] [c.242] [c.310] [c.508] [c.203] [c.70] [c.85]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология