Конъюгат ферментом

Промойте планшеты 3 раза буфером для отмывки и добавьте в каждую лунку по 50 мкл конъюгата фермента с антителом второго порядка. Инкубируйте в течение 1 ч, затем промойте планшеты 3 раза буфером для отмывки и один раз PBS. [c.186]

К перспективным можно отнести конъюгаты ферментов с бел- [c.112]

Рассмотренные выше методы гетерогенного иммуноанализа основаны на использовании ковалентных конъюгатов фермента с антителами или антигенами. В настоящее время этот [c.102]

Получение конъюгатов фермент — белок [c.182]

Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими карбоксильную группу. Самыми распространенными методами син- [c.192]

Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими углеводные остатки. Такие гаптены, как дигоксин, аденозин и другие, имеющие в своей структуре углеводные группировки, могут быть легко конъюгированы с ферментами путем их окисления перйодатом натрия до производных с альдегидной группой и последующим взаимодействием с ЫНг-группами фермента [c.196]

ИФА с разделением компонентов, основанный на использовании конъюгатов [фермент — лиганд], [c.28]

Этот метод основан на блокировании антителами дополнительного маркера (якоря Я) в конъюгате [фермент—лиганд— якорь]. Принцип метода, схематически представленный на рис. [c.28]

Отделение маркированного конъюгата [фермент—лиганд—якорь], связавшегося с антителами (Ат Л—Ф—Я), от свободного Л—Ф—Я путем присоединения Л—Ф—Я к иммобилизованному рецептору (ИР) с образованием Л—Ф— Я ИР (реакция III) и последующего непродолжительного центрифугирования. Связывание Л—Ф—Я и ИР происходит на гетерогенной поверхности, разделяющей твердую и жид-.кую фазы. Маркер Я, содержащийся в комплексе Ат Л— Ф—Я, не способен соединяться с ИР — этому мешают Ат. [c.28]

Предложены два способа исключения помех со стороны сыворотки при иммуноанализе ферритина. Во-первых, конъюгат [фермент—ферритин] будет защищен от антифермента, если связать фермент с большим числом молекул альбумина. Инте- [c.111]

Конъюгат (фермент-антитело) [c.246]

Приготовление конъюгатов ЩГС-МБ— -галактозидаза и [К-МБ— -галактозидаза ]. Присоединение КГС-МБ или К-МБ к i-галактозидазе в 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,0 (буфер А), и очистку конъюгата [фермент-гаптен] на колонке с сефадексом G-25 проводили аналогично процессу получения и очистки конъюгата [Т4— -галактозидаза]. [c.267]

Иммуноферментный анализ с использованием дополнительно маркированных конъюгатов фермент — лиганд [c.275]

Появление загиба может быть связано с влиянием двух факторов, одним из которых является конкуренция в условиях избытка антигена за связывание со вторыми (меченными ферментом) антителами. В случае радиально-распределительного анализа этот процесс сводится к минимуму или даже полностью подавляется, поскольку в процессе внесения в систему раствора конъюгата [фермент—антитело] происходит вымывание избытка антигена, не связавшегося с антителами на первой стадии процесса. Вторым фактором, ответственным за появление загиба, может служить частичная потеря в ходе проведения второй стадии антигена, связавшегося на первой стадии. Поскольку в нашем случае вторая реакция протекает менее чем за три минуты, возможные потери связавшегося антигена должны быть минимальными. [c.315]

Наличие разных моноклональных антител к одному и тому же продукту лежит в основе количественного иммунологического анализа белка методом сэндвича , когда одно антитело используется в качестве твердой фазы для связывания присутствующего в растворе антигена, а другое антитело используется в качестве меченого зонда для обнаружения иммобилизованного материала. Хотя мы работали как с зондами, меченными так и с зондами, меченными ферментативно активными конъюгатами (в последнем случае обычно к антителам присоединяли биотин и использовали конъюгат фермента с авиди-ном), здесь мы приводим описание только первой методики, поскольку в нашей практике она оказалась более удобной. Этот метод пригоден также и для выяснения следующего вопроса о том, конкурируют ли между собой антитела за взаимодействие со стерически тесно ассоциированными участками, а также для изучения белок-белковых взаимодействий. [c.197]

Принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией в результате создания иммобилизованных ферментов. Дж. Нельсон и Е. Гриффин еще в 1916 г. показали, что инвертаза, адсорбированная на угле (т. е. иммобилизованная), сохраняет каталитическую активность. В 20—30-х годах работы по изучению адсорбции белков и ферментов были продолжены, однако исследования этого периода представляли главным образом академический интерес и не преследовали практических целей. В 1939 г. Дж. Пфанмюллер и Г. Шлейх получили первый патент на применение адсорбированных на древесных опилках протеолитических ферментов для обработки шкур. Принципиально важный шаг в направлении создания прочных конъюгатов ферментов с носителями был сделан в 1953 г. И. Груб-хофером и Д. Шлейтом, впервые применившими метод ковалентного связывания. [c.6]

Одним из щироко используемых для этой цели лектином является конканавалин А из бобов конавалии (Мг = 96 000). Ковалентный конъюгат антител с лектином получают с помощью глутарового альдегида. Выделенные конъюгаты могут использоваться для определения антигенов и антител. Одна из возможных схем проведения ИФА антител на основе конъюгата фермента с лектином имеет вид [c.107]

На практике данный подход был реализован на примере многих низкомолекулярных антигенов и других ферментов — малатдегидрогеназы печени свиньи и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, и также известен под названием EMIT . Используют конъюгаты ферментов с гаптенами, которые незначительно отличаются по активности от нативного фермента. При взаимодействии с антителами против гаптена в молекуле фермента происходят конформационные изменения, затрагивающие структуру активного центра, в результате чего ферментативная активность сильно падает. Введение в реакционную систему свободного антигена приводит к уменьшению концентрации комплексов конъюгат—антитело, а сдедовательно, измеряемая активность при увеличении концентрации анализируемого соединения также возрастает. [c.117]

ИФА, основанный на использовании антител против активного центра фермента. При использовании сывороточного альбумина человека как модельного антигена разработан гомогенный ИФА, основанный на конкурентном связывании с конъюгатом фермент — антиген двух типов антител специфических антител против определяемого антигена и антител против фермента, вызывающих при связывании полную потерю его каталитической активности. Вследствие стерических затруднений связывание с конъюгатом антител против антигена приводит к потере способности взаимодействия антител второй специфичности с ферментом. В присутствии определяемого антигена доля специфических антител, вязанных с конъю- [c.117]

Получение фрагментов антител. При разработке некоторых модификаций ИФА может возникнуть необходимость использования конъюгатов фермента не с целой молекулой иммуноглобулина, а с тем ее фрагментом, который специфически связывается с молекулой антигена —Fab-фрагментом. Обусловлено это прежде всего тем, что рс-фрагмент молекулы, ответственный за эффек-торные функции иммуноглобулина, обладает способностью неспецифически взаимодействовать с другими белками, сорбированными на носителях при проведении твердофазного ИФА. Эффект неспецифической сорбции определяется природой антигена, концентрацией сорбированного на носителе белка и рядом других факторов. [c.155]

Кроме того, должно быть тщательно выбрано место прищивки гаптена к ферменту, так как это влияет на специфичность анализа. Показано, что специфичность анализа для гаптенов выше, если конъюгат фермент—гаптен получен способом, отличным от метода синтеза конъюгата гаптен-носитель, используемым для иммунизации. [c.192]

Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими аминогруппы. Метод с применением гомобифункциональных сшивающих реагентов. Самый простой способ получения конъюга- [c.194]

Иммунофильтрация. Под иммунофильтрацией понимают определение вещества методом иммуноанализа после его выделения из пробы фильтрацией через полупроницаемую мембрану. В наиболее простом варианте антиген удерживается мембраной неспецифически, только благодаря определенному размеру ее пор. Далее его определяют с помощью конъюгата фермент - антитело. Этот метод использован для определения ассоциатов вирусов с клетками [1, 2], однако он не применим к растворимым антигенам или свободным вирусам. В этом случае необходимый антиген специфически связывают с антителами на мембране. [c.80]

В ферментативной иммунохроматографии также используются конъюгат фермента с определяемым веществом и специфические антитела против последнего. Однако в отличие от EMIT здесь определение не связано с изменением активности конъюгата в комплексе с антителом. Принцип метода ферментативной иммунохроматографии представлен на рис. 6.4. Определенный объем пробы смешивают с раствором, содержащим конъюгат фермент -гаптен и соответствующий ферментный реагент. В рассматриваемом примере сопряженным ферментом является пероксидаза из корней хрена, а ферментным реагентом - глюкозооксидаза. Глюко- [c.84]

М Mg b, 0,04% азнда натрия н 5% БСА). Раствор конъюгата фермент — антитело можно хранить при 4 С пе мепсе года. [c.330]

По точности и достоверности ИФА без разделения, основанный на применении конъюгатов [фермент — лиганд], сопоставим с другими иммунологическими (например, РИА) и неиммунологическими методами (например, газовой, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографией) (Jaklits h 1985). [c.14]

Для ИФА, основанного на использовании конъюгатов фермента со вторыми видоспецифичными антителами, важное значение могут приобретать проблемы, связанные с циркулирующими иммунокомплексами. В качестве примера можно отметить анализ на содержание антител против двухцепочечной ДНК, в котором в роли индикаторного реагента используются конъюгированные с ферментом антитела к IgG человека. В ходе анализа индикаторный конъюгат образует сэндвич со связанным IgG (специфичным к ДНК). Если в сыворотке пациента присутствуют иммунокомплексы, в состав которых входит IgG, то в ходе проведения первой стадии реакции они могут сорбировать- [c.182]

Метод непрямого конкурентного анализа является вполне функциональным, хотя и весьма громоздким вследствие значительного числа этапов, составляющих процесс детектирования в a-ELISA. В лабораториях, где работают с a-ELISA, целесообразно использовать, этот метод для предварительного изучения принципиальных возможностей применения непрямого ИФА для тестирования данного антигена, поскольку для этого не потребуется приготовления каких-либо новых реагентов. Для последующей рутинной работы предпочтительно использовать конъюгат фермента с антителами к тестируемому антигену. [c.241]

ВХОДИТ несколько молекул моновалентных антител, неизбежно ограничивает чувствительность определения до значений, характерных для конкурентных методов. Это обусловлено невозможностью отделения полностью свободных антител от би- или поливалентных антител, у которых хотя бы один из центров связывания остался свободным —и те, и другие будут связываться с сорбентом. В то же время в ряде случаев требования к чувствительности определения антигена таковы, что их вполне удается удовлетворить с использованием немономерных конъюгатов [фермент — моновалентные антитела], особенно при наличии антител с высоким сродством к антигену. В качестве примера можно отметить разработку на основе ИААК чувствительного (нижний предел обнаружения 0,2 нМ) и очень точного (коэффициент вариации меньше 3%) автоматизированного метода определения дигоксина (Leflar et al., 1984). В этом случае для детектирования использовали немономерный конъюгат типа [F(ab )s — р-галактозидаза]. [c.247]

Хотя, строго говоря, метод ИААК должен быть отнесен к классу гетерогенных ИФА, этап разделения связанных и свободных реагентов в этом методе осуществляется настолько просто и быстро (особенно при использовании соответствующего оборудования), что позволяет сопоставить его с современными вариантами гомогенного анализа. Время инкубации после добавления к образцу препарата моновалентных антител, конъюгированных с ферментом, определяется главным образом концентрациями антител и антигена, поскольку их взаимодействие в данном случае представляет собой простую обратимую бимолекулярную реакцию, зависящую только от диффузии. В табл. 15-1 представлены результаты расчета скорости взаимодействия антиген — антитело в зависимости от их относительного содержания в реакционной смеси. Единственным допущением при расчетах является величина константы скорости прямой реакции ЫО л моль -с выбранная на основании данных, полученных для большинства исследованных систем взаимодействия небольших антигенов с антителами (Pe ht, 19 2). Из расчетных данных табл. 15-1 следует, что даже для определения тестируемого компонента, концентрация которого не превышает пикомолярного уровня, использование большого избытка конъюгата [фермент—антитело] (на наномолярном уровне) позволяет ожидать быстрого количественного связывания и завершения анализа не более чем за 5—10 мин. Кривая, построенная на основании изучения кинетики связывания дигоксина с мономерным конъюгатом [Fab — -галактозидаза] (рис. 15-2), подтверждает справедливость расчетных оценок. Концентрации дигоксина и конъюгата в этих экспериментах составляли 0,2 нМ и 10 нМ соответственно. Как видно на ри- [c.249]

Получение конъюгата [фермент — гаптен]. Присоединение ДСА-МБ к -галактозидазе осуществляют так же, как это описано для Т4 в разделе, посвященном ИФА Т4. К 1,5 мл 0,5 М фосфатного буфера, pH 7,0, содержащего 0,5 мг -галактозидазы (0,93 нмоль), добавляют раствор ДСА-МБ ТГФ (0,2 мг/мл, 10 нмоль). Смесь инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После диализа в течение ночи против того же фосфатного буфера смесь очищают хроматографией на колонке (1,5x40 см) с сефадексом G-25. Для анализа дигоксина используют фракции с максимальной ферментативной активностью. [c.269]

Конъюгат [антитело — щелочная фосфатаза], содержащийся в избытке, катализирует образование окрашенного продукта прямо пропорционально концентрации фермента, причем эта зависимость, по-видимому, сохраняется и при А405>2 ед., где уже оптическую плотность нельзя надежно измерить. Для расширения концентрационного диапазона (в рамках сохранения линейности) можно попытаться измерять оптическую плотность при длине волны, соответствующей меньшей экстинкции (Saunders et al., 1984). Максимум поглощения для л-нитрофенола соответствует Х=405 нм. При Я,=450 нм экстинкция л-нитро-фенола составляет примерно одну пятую экстинкции в максимуме. Это означает, что, проводя измерения при двух длинах волн — 405 и 450 нм, можно в пять раз поднять допустимый верхний предел концентрации тестируемого компонента. При работе с обычным спектрофотометром это связано с необходимостью постоянного переключения длины волны с 405 на 450 нм для каждого образца. В то же время на фотометре со сменными фильтрами, рассчитанном на несколько длин волн и управляемом микропроцессором, можно делать то же самое в автоматическом режиме. Сравнивая значения поглощения, полученные при двух длинах волн, процессор может выбирать одно из них, более подходящее для расчета концентрации образца. По-стройшая таким образом система обеспечивает высокую чувствительность благодаря измерениям в максимуме и в то же время позволяет одновременно расширить концентрационный диапазон за счет дополнительных измерений при длине волны, соответствующей меньшей экстинкции. Существенно помнить, что чувствительность ферментативного иммунометрического анализа практически полностью определяется удельной ферментативной активностью конъюгата [фермент — антитело]. В связи с этим любое повышение удельной активности конъюгата, не сопровождающееся усилением его неспецифического связывания, будет приводить к повышению чувствительности, т. е. к снижению минимального значения концентрации тестируемого компонента, поддающегося определению данным методом анализа. [c.392]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология