Авидин МАБ-метод

Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин — биотин, который образуется с 10 М-> по схеме [c.191]

Для этого метода предварительно синтезируют каким-либо химическим методом конъюгаты антител с биотином и фермента с авидином, а затем при простом смешивании реагентов — конъюгат. [c.191]

В работе [45] описан другой метод десорбции связавшегося материала с матрицы с использованием изоэлектрического фокусирования. Аффинный гель помещается в предварительно фокусированный градиент pH, который получают электрофорезом плоского слоя амфолитсодержащего геля. Система работает при низкой силе тока и высоком напряжении. Хотя ни этот метод, ни электрофоретическая десорбция по существу не были оптимизированы, оба метода открывают возможность проводить десорбцию в мягких условиях даже в случае систем с высоким сродством, таких, как биотин — авидин и антиген — антитело. [c.121]

Следующий метод нековалентного введения ферментной метки в гетерогенном ИФА антигенов и антигел основан на использовании авидина (основной гликопротеид, Л4г = 66000, компонент яичного белка) и биотина (витамин, Мг=22Ъ), образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 цто в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген — антитело. Один из вариантов ИФА антител с использованием этой техники может быть проведен по схеме (см. с. 106). [c.105]

В нашей лаборатории для разработки различных методов иммуноанализа мы применяли имеющиеся в продаже конъюгаты авидина с ферментами, а также синтезировали препараты биотинилированных белков и стрептавидина с хемилюминесцентной меткой. [c.67]

Авидин и стрептавидин в качестве меченых зондов. Принципиальная схша этого метода представлена на рис. 5.3. Исследуемый образец инкубировали с высокоаффинными моноклональными антителами, ковалентно связанными с полистирольными шариками диаметром 6,5 мм [19 ]. Затем в систему вводили биоти-нилированные антитела к другим эпитопам антигена. По завершении иммунологической реакции добавляли авидин, меченный ферментом, или содержащий хемилюминесцентную метку стрептавидин. В зависимости от используемого маркера измерение осуществляли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции. [c.68]

Таблица 5.2. Сравнение двух методов иммунометрического определения hGH с использованием авидин-биотиновой реакции

Биотин и авидин являются нефлуоресцирующими молекулами, которые обладают высоким сродством друг к другу. Они легко присоединяются к антителам и многим флуорохромам. Чаще всего биотин конъюгируют с антителами, а авидин — с флуорохромами. Обычно клетки сначала инкубируют с био-тинилированными антителами, а затем с конъюгатом флуоро-хром-авидин (как это делают при непрямом способе детектирования). С помощью этого метода можно выявлять антитела по флуоресценции разного цвета в зависимости от используемого для конъюгации с авидином флуорохрома. Более важным, однако, является то, что система авидин — биотин часто позволяет решить проблему мечения антител определенными флуорохромами. Поскольку биотин относительно легко конъюгирует с антителами, а авидин — с большинством флуорохромов, даже в тех случаях, когда не удается непосредственно присоединить флуорохром к антителам, их можно выявлять непрямым способом. [c.334]

Первые попытки достижения воспроизводимости анализов биологических жидкостей при прямом вводе пробы связаны именно с непосредственной белковой сорбцией на сорбенте. Так, еще в 1982 г. X. Йошида с сотр. предложили вариант обработки колонок, заполненных обращенно-фазовым сорбентом is (20-30 мкм, dp = 12 нм), путем пропускания раствора БСА или плазмы кролика в метаноле при pH = 3. После повторной промывки метанолом для удаления денатурированного неадсорбированного белка колонку использовали для анализа плазмы крови [102, 103]. Однако такая обработка колонок приводила к существенному снижению эффективности разделения, особенно при применении метода к мелкозернистым (5 мкм) сорбентам. Наряду с этим время жизни таких колонок было сравнительно коротким, что неудивительно, поскольку динамическое модифицирование белком проводили в неравновесных условиях, а денатурированный и химически незакрепленный белок удерживался только адсорбционными силами. Поэтому в более поздних разработках эти авторы использовали колонки, приготовленные таким образом лишь для предварительного концентрирования в системах с переключением колонок при анализе плазмы крови с прямым вводом [104, 105]. Дальнейшая работа этой группы [49] связана, в основном, с иммобилизацией авидина и овомукоидов на активированных ХМК и применением последних в сложных автоматизированных системах для анализа биологических жидкостей. [c.555]

Предложено несколько способов дальнейшего повышения чувствительности ферментных меток. Например, в методе ELISA с усилением используют комплексы ферментов со специфическими антителами (Butler et al, 1985) в системе ЛВС применяют комплексы авидина с конъюгатом [биотин — фермент] и конъюгаты биотина с антителами (Hsu, 1985). [c.32]

Рис. 18-5. Стандартная кривая для тестирования ДНФ-лизина с помощью метода ИФАЯМ. К 200 мкл раствора с фиксированным содер-жанием конъюгата [ДНФ-лизин — р-галактозндаза — биотин] (1,36 нмоль) добавляли по 100 мкл раствора с различным содержанием свободного ДНФ-лизина. К смесям добавляли по 0,5 мкл ДНФ-специфнческой антисыворот-кн и по 500 мкл 10%-ной суспензии авидин-сефарозы. Инкубировали 30 мин при 25 °С и центрифугировали 5 мин. В супернатантах (800 мкл) определяли активность фермента (светлые кружки). Осадки трижды промывали и определяли в них активность (темные кружки), как описано цля рис, 18-3,

Препятствием к широкому распространению метода ИФАЯМ в его разработанном на сегодня варианте является принципиальная необходимость проведения стадии разделения и сравнительно высокая стоимость авидина. [c.283]

Иммунопероксидазные методы с использованием системы авидин — биотин [c.413]

Применение методов на основе авидин-биотиновой системы [c.414]

Важнейшее преимущество методов анализа, основанных на применении авидин-биотиновой системы, заключается в том, что любое вещество, конъюгированное с биотином, можно обнаружить по взаимодействию с авидином. В отличие от других иммунологических методов для этого метода использование взаимодействий антиген — антитело не обязательно. Приведем не- Сколько примеров [c.414]

Любые вещества, меченные биотином, включая и иммуно-тлобулины, могут быть обнаружены с помощью авидина, кова--лентно или нековалентно связанного с тем или иным индикатором, В зависимости от системы обнаружения индикаторным компонентом могут служить красители — сульфородамин, флуоресцеин, родамин, а также ферритин, коллоидное золото фер- менты — пероксидаза, щелочная фосфатаза и др. Таким образом, авидин-биотиновая система может быть использована в самых разнообразных методах анализа, включая иммуногистохимиче- Ские и электронно-микроскопические, методы обнаружения ан- [c.414]

Можно использовать одну из трех основных разновидностей системы авидин — биотин 1) меченый авидин — биотин (МАБ-метод), 2) авидин-биотиновый мостик (АБМ-метод) и 3) ави-дин-биотиновый комплекс (АБК-метод). В рамках МАБ-метода вещество, меченное биотином, непосредственно обнаруживают по взаимодействию с авидиновым конъюгатом типа [авидин — флуоресцеин] или [авидин — пероксидаза]. Хотя использование-авидин-пероксидазного конъюгата обеспечивает достаточно высокую чувствительность определения, следует отметить и существенный недостаток этого метода — высокий уровень фона и неспецифическое окрашивание тканей некоторых типов, в частности почечных тканей. [c.415]

В АБМ-методе авидин используется в роли мостика между двумя или более молекулами биотинсодержащего конъюгата типа [биотин — антитела] или [биотин — пероксидаза]. Этот метод основан на том, что авидин содержит четыре центра связывания биотина. Теоретически он должен характеризоваться более высокой чувствительностью, чем МАБ-метод, благодаря возможному усилению в системе взаимодействий биотин — авидин — биотин. Молекулы авидина, связывающиеся с конъюгатом-антитела — биотин], вообще говоря, могли бы связать еще [c.415]

С целью повысить чувствительность анализа мы разработали метод, основанный на применении комплекса [авидин — биотин — пероксидаза] (АБК-метод). Тот же принцип был положен в основу разработанных недавно вариантов АБК-метода с применением комплексов [авидин — биотин — щелочная фосфатаза] и [авидин — биотин — глюкозооксидаза]. Образование названных комплексов в АБК-методе обеспечивается следующими биохимическими характеристиками авидина и биотинсодержащих конъюгатов [c.417]

Благодаря очень высокому сродству между авидином и биотином при использовании метода, основанного на образовании авидин-биотинового комплекса, достигается чрезвычайно высо кая чувствительность определения. Одним из важнейших пре- [c.421]

Отметим, что для детекции антител разработаны также и нерадиоактивные (хромогенные) методы. Они основаны на свойствах пе-роксидазы из хрена и щелочной фосфатазы образовывать цветные нерастворимые продукты в процессе ферментативной реакции. Эти ферменты ковалентно связывают с вторичными антителами, которые реагируют со специфическими сайтами на первичных антителах После обработю фильтров такими комплексами в местах локализации искомых белков образуются суперкомплексы антигек — антите-ло антитело — фермент. Их положение определяют смочив фильтр в растворе проявляющего вещества (субстрата ферм нта). Например, для пероксидазы хрена хромогенным субстратом является 4-хлоро-1-нафтол, способствующий появлению на фильтрах пурпурных пятен. В качестве альтернативного метода вторичные антитела связывают с биотином, а пероксидазу хрена — с авидином. [c.286]

Был описан интересный способ получения одноцепочечной матрицы ДНК, легший позднее в основу такого высокопроизводительного метода как твердофазное секвенирование (рис. 2.7) [Stahl et al., 1988]. В цитируемой работе фрагмент ДНК, меченный биотином, сорбировался на твердой фазе в виде авидин-агарозы. После этапов денатурации щелочью и последующей отмывки на оставшейся одной цепи ДНК, связанной через биотин-авидиновый комплекс с агарозой, отжигался секвенирующий праймер и шло построение комплементарной цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы в условиях терминации. Затем еще один раунд щелочной денатурации приводил к высвобождению новосинтезированных цепей ДНК, пригодных для их разделения секвенирующим гель-электрофорезом. Справедливости ради следует отметить, что авторы в данной статье упоминают о принципиальной возможности повторения циклов отжига праймера и построения цепи по сорбированной матрице, что [c.56]

Для увеличения чувствительности при иммуноблоттинге используются системы с биотинилированными вторичными антителами. Данный метод использует сродство биотина и авидина. Поскольку стрептавидин связывает несколько молекул биотина, связывание фермента с интересующими белковыми зонами усиливается. Другое преимущество данной системы - способность обнаруживать белки, связанные с положительно заряженной нейлоновой мембраной. Данная система обладает в 10-50 раз более высокой чувствительностью, а также не требует наличия метанола в буфере для переноса. [c.68]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология