Щелочной градиент сахарозы

При высоких значениях pH ДНК денатурирует. Таким образом, денатурированную ДНК можно исследовать в щелочном градиенте сахарозы (т. е. 5—20% сахарозы в 0,1—0,3 М ЫаОН) . [c.319]

Пример 11-М. Обнаружение радиационных повреждений в бактериальной ДНК. При обработке меченной Н-тимидином бактерии ферментом лизоцимом, который разрушает часть клеточной стенки бактерии, и быстром нанесении полученного препарата на щелочной градиент сахарозы лизис бактерии будет завершаться при действии щелочи, а ДНК при этом будет денатурировать. Последующее центрифугирование показывает, что большая часть ДНК имеет очень высокий 5 (рис. 11-35). Если же перед лизисом клетки подвергнуть рентгеновскому облучению, значение 5 существенно понижается, указывая тем самым на то, что облучение приводит к одноцепочечным разрывам. Из эмпирического соотношения между 5 и М можно рассчитать число одноцепочечных разрывов и сравнить его с дозой радиации. Этот подход позволяет установить связь между разрывами цепей и убивающим действием рентгеновских лучей. [c.323]

Бактерию выращивали в присутствии н-тимидина, подвергали лизису и седиментировали через щелочной градиент сахарозы. Сверхспирали фактора F составляют приблизительно 17о от общего количества ДНК, однако они легко отделяются вследствие высокого значения s в щелочи. / — фактор F 2 —хромосома. [c.324]

Разделение ДНК в градиенте плотности. Центрифугирование в щелочном сахароз- [c.892]

В последнем замечании содержится намек на то, что опасность выпадения осадка в изоэлектрической точке существует и для самих очищаемых ИЭФ белков. Это действительно так, что иногда заставляет принять особые меры по увеличению растворимости этих белков. Иной раз присутствие сахарозы неблагоприятно сказывается на растворимости белка. В этом случае следует построить градиент плотности путем добавления к раствору амфолитов глицерина (до 60%), этиленгликоля (до 75%) или сорбита (до 50%). Кстати, если фокусирование предполагается вести при рН>9, то сахарозу вообще лучше заменить сорбитом. В щелочной области pH сахароза диссоциирует как слабая кислота и может нарушить характер градиента pH, образуемого амфолитами. [c.72]

Однонитевые разрывы ДНК. Индуцированные облучением однонитевые разрывы ДНК (ОР) впервые были продемонстрировены с помощью метода "седиментации в щелочном градиенте сахарозы". Для продольного разделения ДНК на составляющие ее нити используют экстремальные щелочные условия (pH = 12). Клетки помещают в специально при-готовленнь1Й раствор сахарозь , затем центрифугируют при большой скорости. [c.35]

Щелочной градиент сахарозы используют для денатурации ДНК, обнаружения скрытых разрывов, оценки истинных размеров развернутой молекулы ДНК. При pH 12,1—12,3 линейные молекулы ДНК денатурируют, а плазмиды сохраняют свою двунитевую кольцевую структуру. Щелочные градиенты обычно получают, растворяя сахарозу в 0,1—0,3 М NaOH с 0,7- [c.238]

Единственное осложнение при использовании этого метода заключается в том, что сахароза при высоких концентрациях проявляет заметные буферные свойства в диапазоне pH 10—И. Кроме того, ее буферная емкость существенно возрастает с понижением температуры. Таким образом, д.пя приготовления щелочных градиентов сахарозы нельзя применять разбавление буфера с pH 12,5 с последующим прибавлением сахарозы. Чтобы обеспечить денатурацию, pH доводят до нужного значения после добавления сахарозы, причем это необходимо делать при той же температуре, при которой будет проводиться седиментация. Применение 0,3 М ЫаОН позволяет решить эту проблему. Все щелочные растворы сахарозы должны содержать хелатирующий агент, такой, как ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), для предотвращения катализируемого ионами металлов гидролиза фосфоднэфирных связей. [c.319]

Пример 11-Л. Идентификация небольилих фрагментов вновь синтезируемой ДНК фрагменты Оказаки, При выращивании бактерии Е. соИ в среде, содержащей Н-тимидин, в течение многих поколений синтезируемая ДНК будет включать Н. Прн выделении этой ДНК и седиментации при нейтральном pH установлено, что значение s указывает на ее высокую молекулярную массу. Однако при седиментации этой же ДНК в щелочном градиенте сахарозы оказалось, что небольшая часть ДНК седиментирует очень медленно (рис. 11-34, Л). Из этого было сделано предположение, что часть двухцепочечных молекул ДНК содержит близко расположенные одноцепочечные разрывы. Если нерадиоактивные клетки выращивать в течение всего лишь 5 с (0,2% поколения) в радиоактивной среде, затем отделять и анализировать в щелочном градиенте сахарозы, оказывается, что ббльшая часть радиоактивности (т. е. вся ДНК, синтезированная за период 5 с) содержится во фракции с очень малым 5 (рис. 11-34, Б). Синтезированная за это время ДНК должна иметь множество близко расположенных одноцепочечных разрывов. Если клетки после выращивания в течение 5 с в радиоактивной среде перенести вновь в нерадиоактивную и выращивать в ней в течение 10 мин (74 поколения), седиментационный анализ в щелочном градиенте сахарозы показывает, что вся радиоактивность находится во фракции с высоким s (рис. 11-34, ), т. е. старая ДНК не содержит одноцепочечных разрывов. Эти [c.322]

Л — необлученная бактерия Б бактерия, облученная рентгеновскими лучами. Клетки обрабатывали лизоцимом и наносили слоем на щелочной градиент сахарозы. Лизис и высвобождение ДНК происходит в слое данные получены в лаборатории университета Брандейс), [c.324]

Мэтью Мезельсон и автор этой книги использовали данный метод для того, чтобы показать, что ДНК профага вставляется в бактериальную ДНК. Штамм Е. oli, содержащий кольцевой половой фактор с местом присоединения для фага подвергали лизогенолизу. Половой фактор вместе с присоединенным профагом выделяли и комбинацией центрифугирования в щелочном градиенте сахарозы и в s l, содержащем бромид этидия, показали, что он обладает кольцевой структурой большей величины. Однако этот тест не давал возможности сделать выбор между двумя альтернативами, так как лизогенная форма могла представлять собой большее кольцо или катенан, состоящий из связанного полового фактора и кольца К. После введения одноцепочечных разрывов при обработке рентгеновскими лучами кольца получали плотность, совпадающую с плотностью линейной ДНК, причем не было обнаружено зон с промежуточной плотностью. Отсюда был сделан вывод, что лизогенная форма представляет собой непрерывное кольцо. [c.344]

Наряду со смесью амфолитов, обеспечивающей формирование градиента pH на весь биохимически интересный диапазон (pH 2,5—10), с целью более тонкого разделения белковых полос фирмы выпускают и смеси амфолитов для относительно узких (шириной в 1,5—3 единицы), перекрывающихся между, собой интервалов pH (2,5—4 3,5—5 4—6 5—8 и т. д.). Смеси сервалитов в интервале pH 4—5,5 выпускаются даже для долей этого интервала шириной всего в 0,5 ед. pH. Следует иметь в виду, что эти интервалы указываются для ИЭФ в градиенте сахарозы. При использовании амфолитов для ИЭФ в геле какая-то доля щелочного участка указанного в маркировке интервала pH за счет эндосмоса неизбежно уходит из геля к катоду, поэтому следует готовить и использовать смеси продажных амфолитов, как это будет рекомендовано ниже. [c.16]

Пример 10. Малые фрагменты ДНК после переваривания ДНКазой 1 [Hell et al., 1972]. Разделение проводили в очень пологом щелочном градиенте 5—10% сахарозы центрифугированием в бакет-роторе MSE (6Х 14 мл) при 24,5 тыс. об/мин и 20° в течение 36,5 ч. Молекулярную массу фрагментов рассчитывали, используя соотношение S2o> > = 0,0528 Ai"-. Для нейтральных градиентов и нативной ДНК соответствующая зависимость [Studier, 1965] имеет вид S2o, = 0,0882 Л "- . [c.239]

Штамм бактерии Е. oli, лизогенный по фагу заражали фагом К. Известно, что вводимая ДНК превращается в смесь открытых и ковалентно замкнутых колец, которые легко можно различить, исследуя их седиментацию в градиенте щелочного раствора сахарозы (гл. 11). Изображены две картины седиментации. График А получен при использовании фага, меченного Н-тимидином, и на нем изображена только радиоактивная, ДНК. Две формы здесь легко различаются. На графике Б изображена зависимость концентрации всей ДНК от градиента, поскольку использовался нерадиоактивный фаг Так как бактериальная ДНК присутствует в большом избытке, ДНК фяга проявляется в виде плохо различимых горбиков, / — ковалентно замкнутые кольца 2 — открытые кольца. [c.127]

Модификация метода Лоури, делающая его пригодным для измерения белка в пробах, содержащих сахарозу или ЭДТА, а также в препаратах мембран и липо-протеинов, описана Марквеллом и др. [91]. Эта методика основана на применении детергента (додецилсульфата натрия, ДСН) в составе щелочного карбонатного реактива для увеличения солюбилизации липоидных веществ и на использовании повышенного количества тартрата меди для предотвращения помех за счет сахарозы и ЭДТА. Методика применима в нескольких случаях, в том числе при определении белков во фракциях из сахарозных градиентов. [c.358]

Свендсен [1254] сконструировал аппарат, в котором фракционирование содержимого колонки с градиентом плотности осуществляется при включенном электрическом поле. В этом аппарате нижний электрод отделен от колонки полупроницаемой мембраной и расположен в опециальном отсеке с подводящей и отводящей трубками, что позволяет прокачивать через него электролит из другого резервуара и таким образам удалять выделяющиеся при электролизе пузырьки газа. По окончании ИЭФ, не отклю чая напряжения, в пространство, находящееся непосредственно над полупроницаемой мембраной, насосом подают концентрированный раствор сахарозы. Одновременно вторым насосом из колонки откачивают жидкость через расположенную над мембраной выводную трубочку, причем скорость отсасывания содержимого колонки должна превышать скорость поступления раствора сахарозы. Благодаря такой разнице в производительности насосов образуется очень стабильная контактная поверхность раздела между поднимающимся снизу плотным раствором сахарозы и опускающейся сверху до уровня выводной трубки менее плотной жидкостью, заполняющей колонку. Описанная система полностью исключает перемешивание раздел ившихся белков, неизбежно происходящее в отсутствие электрического поля из-за наличия диффузии. Поэтому удается получить очень узкие зоны. К сожалению, pH собранных фракций сильно изменяется под влиянием раствора сахарозы, который может быть кислым или щелочным. Вследствие этого невозможно определить изоэлектрические точки выделенных белков. [c.139]

В некоторых случаях возникает необходимость использовать ИЭФ для фракционирования больших количеств веществ. Для этой цели разработана методика непрерывного проточного изоэлектрического фокусирования в градиенте плотности [365] с применением аппарата, обладающего практически неограниченной емкостью. Принцип работы такого аппарата схематически представлен на рис. 58. ИЭФ проводят в прямоугольной ячейке, образованной двумя параллельными стеклянными пластинами, установленными вертикально на расстоянии 0,3 см друг от друга. С одной стороны 1В пространство между стеклами подают растворы, содержащие 1, 2, 3.. .50% сахарозы и смесь амфолитов-носителей, используя для этого 50 каналов 108-канального перистальтического насоса. Катод, расположенный в верхней части ячейки, находится в непосредственном контакте с щелочным раствором, прокачиваемым через четыре верхние трубки. Анод помещен в вертикальный сосуд, отделен-И1ЛЙ от градиента плотности полупроницаемой мембраной. Рас- [c.141]

Метод состоит в следующем. Вертикальную стеклянную колонку заполняют смесью имеющихся в продаже синтетических низкомолекулярных амфолитов-носителей, индивидуальные изоэлектриче-ские точки которых имеют значения, перекрывающие предварительно выбранную область pH. Амфолиты обычно суспендируют в растворе сахарозы, чтобы среда была плотной и в ней отсутствовали конвекционные потоки. Верхний конец колонки (анод) соединен с сосудом, содержащим сильнокислый раствор (например, фосфорную кислоту), а нижний (катод) — с сосудом, содержащим сильно-дделочной раствор (например, этаноламин). При открытии клапанов в сосудах эти растворы начинают диффундировать в колонку каж-.дый со своего конца, и через некоторое время в колонке устанавливается градиент pH с крайними значениями, соответствующими pH кислого и щелочного растворов. После этого клапаны закрывают и включают ток. Амфолиты в растворе мигрируют до тех пор, пока не достигнут области pH, при которой их суммарный заряд равен нулю. Здесь они прекращают движение, стабилизируя тем самым исходный градиент pH. Затем, открыв кран, вводят в верхнюю часть колонки образец. Разделение продолжается от 1 до 3 сут за это время компоненты смеси распределяются по зонам со значениями pH, соответствующими их изоэлектрическим точкам. По завершении разделения выключают ток и фракции, поступающие через кран в нижней части колонки, собирают в пробирки коллектора для последующего анализа. [c.135]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология