Включение метки в молекулы

Большинство выводов относительно механизма этой реакции базируется на результатах исследования состава продуктов. Имеющиеся кинетические данные относятся в основном только к реакторам интегрального типа, в которых степени нревращения слишком велики, чтобы на основе таких данных можно было провести кинетический анализ этой сложной реакции. Обширная информация была получена в результате проведения следующих опытов в поток исходных веществ вводили различные добавки, например предельные и непредельные углеводороды и спирты, а затем определяли, какие превращения претерпевают эти добавки. Введенная газообразная добавка может появляться в продуктах реакции в неизмененном виде, в восстановленном или окисленном состоянии или же может входить в состав продуктов реакции. Включение добавки в молекулу продукта реакции показывает, что эта добавка инициирует рост углеводородных цепей или что она вводится в молекулу вследствие какого-то процесса конденсации или полимеризации. Путем соответствующей метки молекул (например, с помощью радиоактивных изотопов) можно в принципе решить, в каком месте молекулы начинается рост цепи. [c.349]

B. Схематическое изображение распределения молекул ДНК в реплицирующихся хромосомах. Хотя при микроскопическом исследовании радиоавтографов отдельные цепи ДНК не видны, на схеме они изображены в виде линий, чтобы показать, что их распределение соответствует характеру включении метки ыа фото Л и Б. Пунктирные линии соответствуют меченым цепям, а сплошные линии — немеченым. Точки обозначают зерна на радиоавтографах. [c.500]

Радиоавтографические опыты, в принципе аналогичные изображенному на фиг. 243, были впоследствии проведены с быстро делящимися клетками китайского хомячка в этих опытах было исследовано включение метки не только в ДНК, но и в хромосомные белки в ходе последова- гельных клеточных делений. Оказалось, что включение метки в ДНК происходит согласно полуконсервативной схеме, ранее доказанной Тэйлором для корней фасоли вместе с тем включение метки в хромосомные белки происходило совершенно иначе. В первой метафазе после обработки Н-ами-нокислотами белок обеих сестринских хромосом содержал одинаковые количества метки однако спустя три и более циклов деления в отсутствие меченых аминокислот метка практически полностью исчезала из белка метафазных хромосом. Следовательно, можно заключить, что белки, и в частности гистоны, являются лишь временными компонентами хромосомы, материальная и информационная непрерывность которой обеспечивается исключительно молекулой ДНК- [c.501]

Включение метки в молекулы [c.127]

В случае растений введение предшественников [5] обычно осуществляется подпиткой всего растения или его отдельных тканей раствором, а в случае микроорганизмов — добавлением раствора к культуральной жидкости во время фазы максимального продуцирования изучаемого метаболита. Предварительно определяют оптимальную эффективность включения это особенно важно при работе с теми стабильными изотопами, природное содержание которых достаточно велико (например, для С оно равно 1,1 %), т. е. когда необходимо добиться минимального разведения вводимой изотопной метки. При использовании меченых предшественников этот фактор не всегда является решающим, поскольку получающийся метаболит обычно достаточно активен, чтобы его можно было затем развести немеченым ( холодным ) соединением и далее подвергнуть последовательному химическому расщеплению с целью определения распределения метки в молекуле. В стандартных методиках количественного определения радиоактивных изотопов применяются чувствительные счетчики типа Гейгера — Мюллера или, чаще, сцинтилляционные счетчики. Эти приборы исполь- [c.346]

Результаты измерений могут выражаться несколькими способами. В большинстве методик определяется общее число распадов (в единицу времени) в образце, которое умножается на коэффициент, характеризующий эффективность счетчика таким путем получают общую радиоактивность, выраженную в числе распадов в минуту. Деление последней величины на массу образца дает удельную радиоактивность] в некоторых случаях, например, при изучении процессов расщепления, мольная удельная активность может быть разделена на число меченых положений в молекуле. Результаты эксперимента по введению метки выражаются далее либо как включение (общая активность в продукте реакции как часть общей введенной активности), либо как разбавление (отношение удельной активности предшественника к удельной активности продукта реакции), либо как удельное включение (величина, обратная разбавлению). Когда по условиям эксперимента реальный выход продукта превращения низок, предпочтительнее определение удельной активности. Любому из способов выражения результатов свойственен — часто в скрытом виде — ряд трудностей, связанных с количествами эндогенных предшественников и промежуточных соединений ( метаболического пула ), а также с соотношением между скоростью изучаемого процесса и скоростями общих процессов метаболизма [96—98]. Включение меченого ацетата в типичный поликетид в микроорганизмах обычно составляет 1 —10% в растениях эта величина на один — два по- [c.470]

В некоторых случаях достаточно самого факта более или менее эффективного включения предшественника, меченного С или Н, в конечный продукт превращения. В более общем случае, однако, желательно или даже необходимо определить распределение метки в молекуле продукта реакции. Например, классическим доказательством поликетидной гипотезы явилось выяснение того факта, что метка из [1- С]- или [2- С] ацетата располагается в чередующихся атомах углерода [2, И]. Именно относительная трудность установления распределения метки в наибольшей степени ограничивает сферу применения радиоизотопного метода. Определение положения меченых атомов в молекуле предполагает расщепление последней с помощью химических реакций, характеризующихся гарантированной специфичностью и высоким выходом, до все более и более мелких фрагментов — в идеале до одноуглеродных молекул типа СОг или метиламина [109]. Большое значение при этом имеет чистота реагентов и продуктов деградации. Реакции, конечно, могут проводиться только последовательно, и даже самому искусному экспериментатору при самой скрупулезной работе часто необходимо значительно большее количество вещества, чем может быть получено в биосинтетическом эксперименте. [c.472]

Наилучшие результаты дает применение Н в виде двойной метки, обычно вместе с (поскольку в этих случаях может быть применена одна система детектирования). Этот метод можно использовать для выяснения тонких деталей механизмов биосинтеза, в особенности его стереохимических аспектов (так как возможен синтез стереоспецифически меченных Н субстратов) [106, 107], а также для проверки интактного включения сложных промежуточных соединений если включение метки из последних происходит косвенным путем, то это обычно приводит к существенному изменению первоначального отношения Н/ С. Метод имеет свои недостатки, но он позволяет устранить многие из отмечавшихся выше неопределенностей. При очень высоких удельных активностях соединений, содержащих Н ( 1 мКи), атомы Н можно обнаружить и определить их положение в молекуле методом ЯМР этот метод использовали при изучении процессов биосинтеза [108], однако применение его ограниченно. [c.472]

Этот метод заключается в том, что после лизиса клеток хозяина ДНК различных клонов, фиксированную например, на нитроцеллюлозном фильтре, после удаления сопутствующих белков подвергают термообработке, в ходе которой происходит отжиг — раскручивание двунитевых молекул и образование клубков однонитевых ДНК. То же самое продельшают с меченой ДНК-зондом. Если теперь обработать препаратом однонитевой ДНК-зонда раскрученные ДНК клонов при медленном охлаждении, то может произойти образование гибридных двунитевых молекул — гибридазация — и включение метки в фиксированный препарат ДНК. Для образования гибридных молекул достаточно комплементарности последовательностей обеих ДНК из 15-20 нуклеотидов. Вероятность случайного совпадения такого числа комплементарных оснований (или еще более длинных фрагментов ДНК) в неродственных молекулах ДНК ничтожна. Поэтому гибридизация является чрезвычайно селективным и надежным тестом на присутствие родственной молекулы ДНК. [c.106]

Сопоставление длин углерод-углеродных связей, длины палладий-палла-диевых связей в кристалле, длин связей водород-углерод, водород-палладий, палладий-углерод также свидетельствует в пользу того, что гидрирование, миграция и изомеризация двойных связей, а также изотопный обмен (схемы а - ж ) происходят на единичном активном центре, тогда как включение метки в аллильные положения при образовании комплексов тг-аллильного типа определяется кооперативными взаимодействиями на поверхности кристаллов металлов-катализаторов. Этими обстоятельствами (схема д ) можно объяснить, почему при миграции двойной связи в метиловом эфире ундец-10-еновой кислоты образуется в основном цис-изомер (табл. 19.1.2), а при миграции двойной связи в молекулах метиловых эфиров ненасыщенных жирных кислот образуется транс-изомер, при этом метка в основном включается в аллильные положения и при двойных связях (схемы з , и ) (табл. 19.1.4). [c.496]

Свеп гидролизуется в растениях риса с трудом [73], он образует устойчивый комплекс с лигнином. Обнаружены лишь незначительные количества свободного 3,4-дихлоранилина. Йи и сотр. [59а] наблюдали включение метки из меченого пропанида в полимерные компоненты клеток, главным образом в лигнин. В отличие от свепа исходный анилид не включался в состав полимерных молекул метка включалась в состав полимеров клетки только после гидролиза до 3,4-дихлоранилина. [c.136]

Трудности третьего типа возникают тогда, когда меченое соединение биологически не идентично немеченому, т. е. когда имеет 1есто так называемый изотопный эффект . К счастью, биологический изотопный эффект имеет ту же самую основу и подчинЯ ется тем же правилам, что и эффекты химических систем поэтому его учет не представляет больших сложностей для химика. В частности, изотопные эффекты обычно проявляются только у изотопов водорода. Следует иметь в виду, что радиоактивные изотопы обычно занимают только небольшую часть меченых полох<ений . Так, в образце [ 1- С,2-ЗН] ацетата большая часть молекул не содержит ни одного изотопа, практически нет молекул, имеющих оба изотопа, и совершенно отсутствуют соединения, содержащие более одного атома трития. Так, если образец превращается химическим или биологическим путем в СНС СОК, не следует ожидать, что 2/3 всего количества трития будет потеряно наиболее вероятный результат будет зависеть от тонких деталей механизмов превращений. Ситуация складывается совершенно иначе, если все возможные положения действительно заняты атомами изотопа, как это обычно бывает в случае тяжелых изотопов, например [2-2Нз] ацетата. Так, для определения числа атомов водорода, переносимых вместе с атомом углерода в процессе С-метилирования, обычно используют [Ме-2Нз] метионин (при этом основным методом анализа служит масс-спектрометрия). Стереоспецифическое введение метки, например частичное включение в прохираль-ную СНг-группу, широко применяется для изучения стереохимии процессов биосинтеза. В любом случае, однако, следует помнить, что скорость реакций меченых соединений может отличаться от скорости реакций немеченых аналогов, и интерпретировать результаты с необходимой осторох<ностью в общем случае предпочтительным является эксперимент, дающий ответ типа да — нет, а не тот, который можно интерпретировать только на основе неопределенных в количественном отношении изотопных эффектов. [c.469]

Результаты этого опыта представлены на фиг. 243 в виде двух микрофотографий ядер с метафазными хромосомами. В метафазных ядрах две сестринские хромосомы, возникшие в результате репликации ДНК в предыдущей интерфазе, расположены рядом друг с другом в таком виде они готовы разойтись к противоположным полюсам делящейся клетки в последующей анафазе (фиг. 6). Черные зерна, которые можно увидеть над сестринскими хромосомами, образовались в результате действия на фотоэмульсию электронов, выделяющихся при распаде радиоактивных атомов Н, включившихся в хромосомную ДНК. Поэтому плотность зерен над хромосомой пропорциональна количеству содержащихся в ней атомов Н. Как следует из радиоавтографа, приведенного на фиг. 243, две сестринские хромосомы, зафиксированные в конце периода включения метки, содержат молекулы ДНК, меченные в одинаковой степени, тогда как из двух сестринских хромосом, зафиксированных спустя одно деление после включения метки, одна содержит метку, а другая — нет. Схема внизу (фиг. 243) поясняет, что именно такое распределение метки соответствует полуконсервагивной репликации хромосомы, содержащей одну двуспиральную молекулу ДНК. [c.500]

Как показывает радиоавтограф (фиг. 243, Б), полученный спустя один цикл репликации после включения метки, между двумя сестринскими хроматидами произошел реципрокный обмен ДНК- Видно, что, в тО) время как концевой участок одной из двух сестринских хромосом содержит метку, гомологичный участок второй хромосомы ее не содержит в следующем же участке вторая сестринская хромосома содержит, а первая не содержит метки. Такой обмен между сестринскими хромосомами можно легко объяснить механизмом обмена между дочерними цепями ДНК,, рассмотренным в гл. XV в связи с пострепликационной репарацией повреждений ДНК, возникающих при действии ультрафиолета на Е. oli. Как предполагал в 1963 г. Уайтхауз, после репликации молекулы ДНК родительской хромосомы в двух комплементарных дочерних цепях ДНК могут возникнуть одиночные разрывы, расположенные наискосок друг от друга (фиг. 244). Образовавшиеся при этом свободные концы затем удлиняются благодаря ограниченному синтезу, использующему в качестве матрицы родительские цепи ДНК. [c.501]

При увеличении периода мечения большее число молекул оказывается синтезированным полностью, поэтому во фракции целых молекул можно наблюдать градиент включения метки, который уменьшается от С-конца к N кoнцy [c.59]

В циклич. комплексах с В. с., в к-рых каждая молекула образует две B. . с участием атома Н и неподеленной пары электронов атома функц. группы, происходит синхронное перемещение протонов по В. с.-выро ж де нны й обмен между двумя эквивалентными состояниями комплекса. Этот процесс в газовой фазе и в малополярных апротонных р-рителях определяет механизм рьции протонного обмена АН -t- ВН АН -t- ВН (атомы А и В м. б. одинаковыми). Скорость вырожденного обмена растет с увеличением прочности B. . в циклич. димерах карбоновых к-т, комплексах к-т со спиртами константа скорости процесса превышает 10 с" при 80 К. Протонный обмен спиртов с водой, к-тами, вторичными аминами в инертных р-рите-лях или в газовой фазе изучают по скорости установления равновесного распределения изотопной метки или по форуме сигналов спин-спинового взаимод. в спектрах ЯМР. Установлено, что р-ция имеет первый порядок по каждому из компонентов, т.е. является бимолекулярной, константы скорости составляют 10 -10 лДмоль-с), энергия активации-от 4 до 20 кДж/моль. В случаях участия группы АН во внутримолекулярной B. ., включения неподеленной пары электронов в сопряжение (напр., в амидах, пирролах), снижения протонодонорной или протоноакцепторной способности фрагментов (напр., для тиолов, вторичных фосфинов) скорость обмена снижается, энергия активации р-ции увеличивается. Синхронный переход протона в системах с невырожденным обменом иногда м. б. механизмом установления прототропных таутомерных равновесий. [c.404]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология