ель-электрофорез денатурирующий

Рассмотрим теперь метод пептидных карт. Его первый этап состоит в разрыве дисульфидных связей, далее белок денатурируют и расщепляют ферментами, например трипсином или пепсином. В результате получается набор пептидов, размер и аминокислотный состав которых характерен для каждого отдельного белка. Смесь пептидов наносят на лист хроматографической бумаги и проводят в одном направлении хроматографию, а в другом — электрофорез. Пептиды локализуются в виде отдельных пятен, образуя характерную картину ( отпечатки пальцев ), Метод пептидных карт особенно полезен для выявления малых [c.167]

Пожалуй, самым ценным новым методом определения молекулярного веса является гель-электрофорез в присутствии денатурирующего [c.182]

ПЦР-продукты каждой реакции денатурируют, быстро охлаждают и разделяют с помощью электрофореза. Благодаря внутрицепочечному спариванию комплементарных оснований и образованию других связей денатурированная одноцепочечная молекула ДНК принимает определенную трехмерную конформацию, зависящую от ее нуклеотидной последовательности. Вследствие комплементарности две цепи одной молекулы ДНК имеют разную нуклеотидную после- [c.467]

Полученная смесь меченых фрагментов ДНК подвергается электрофорезу в денатурирующем вертикальном полиакриламидном геле. При этом первыми будут двигаться фрагменты, имеющие наименьшую молекулярную массу — в нашем примере цепочки ДНК длиной в 1 нуклеотид. Все они будут нести метку, соответствующую этому нуклеотиду — первому в последовательности. Следующими мимо оптического датчика пройдут цепочки ДНК длиной в 2 нуклеотида — метка на их конце будет соответствовать второму нуклеотиду в последовательности исследуемой ДНК. И так далее, пока последними не пройдут наиболее длинные фрагменты. Следовательно, когда электрофорез закончится, будет получена четкая последовательность нуклеотидов в исследуемом фрагменте. [c.96]

В настоящее время в очистке белков, как и во всех других областях белковой химии, произошли огромные изменения. Разработаны методы большой эффективности и универсальности, и задача разделения белков утратила в значительной мере свою исключительность. Выделение новых ферментов превращается в банальную операцию. Все это результат разработки методов хроматографии и препаративного электрофореза. Хроматография — несомненно самый избирательный п общий метод разделения близких веществ — долгое время не могла применяться в должной степени к белкам вследствие трудностей, связанных с денатурацией. При хроматографии акты сорбции и десорбции повторяются сотни раз. Поэтому необходима полная идеальная обратимость процесса сорбции—десорбции. Однако белки благодаря своеобразию структуры частично денатурировались прп сорбции на ионообменных смолах и потому становились нерастворимыми и не могли хроматографироваться. [c.130]

В случае РНК, обладающих жесткой вторичной структурой (содержащих одно- и двухцепочечные участки), электрофоретическая подвижность в геле зависит не только от размеров их молекул, но и от их состава и нуклеотидной последовательности. Этот эффект может быть использован в практических целях, особенно при попытке разделить одинаковые по размерам, но различающиеся по нуклеотидному составу виды РНК. В этом случае можно варьировать содержание денатурирующего агента в геле либо даже вообще исключить денатурирующие факторы. С другой стороны, чтобы с помощью гель-электрофореза определить молекулярную массу РНК, необходимо предварительно разрушить ее вторичную структуру. [c.178]

При гель-электрофорезе РНК в качестве денатурирующего агента обычно используют мочевину. РНК и ее фрагменты, в состав которых входит от 12 до 150 нуклеотидных звеньев, можно разделить в высокопроцентных полиакриламидных гелях, содержащих 7 М мочевину [85], а более длинные РНК (состоящие из 1500—4500 нуклеотидных звеньев)—в низкопроцентных полиакриламидных или агарозных гелях, содержащих 6 М мочевину [86, 87]. [c.179]

Другим эффективным денатурирующим агентом является деионизованный формамид. Если РНК, растворенные в 98%-ном формамиде, подвергнуть электрофорезу в низкопроцентных полиакриламидных гелях, также содержащих 98%-ный формамид, то подвижность РНК будет определяться размерами их молекул [89, 90]. С помощью этого метода было осуществлено как аналитическое, так и препаративное разделение многих матричных и рибосомальных РНК [78] (рис. 10.7). [c.179]

Одно из серьезных ограничений гель-электрофореза как метода выделения специфических фрагментов ДНК заключается в том, что молекулы, имеющие примерно одинаковую массу, но различную нуклеотидную последовательность, обладают, как правило, одинаковой электрофоретической подвижностью. Один из возможных подходов к решению этой проблемы основан на использовании предложенного в работе Фишера и Лермана [115] метода двумерного гель-электрофореза фрагментов ДНК. Сначала смесь фрагментов ДНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью обычного гель-электрофореза, а затем в перпендикулярном направлении проводят электрофорез в 4%-ном полиакриламидном геле в градиенте концентрации формамида (от 4 до 30%) и мочевины (от 0,7 до 5,25 М). Разделение проводят при повышенной температуре. В этой методике использован эффект резкого уменьшения электрофоретической подвижности в результате денатурации или плавления части нативной молекулы ДНК. В ходе электрофореза во втором направлении фрагменты ДНК подвергаются воздействию все более жестких денатурирующих условий, и плавление части молекулы двухцепочечной ДНК сопровождается скачкообразным изменением ее подвижности. Связь между подвижностью фрагментов ДНК и их нуклеотидной последовательностью носит сложный характер и до сих пор окончательно не выяснена [115], [c.185]

Эти олигонуклеотидные фрагменты разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, обладающего высокой разрешающей способностью [129, 135] (рис. 10.12). Чтобы исключить возможность образования внутримолекулярных вторичных структур (этот процесс особенно характерен для длинных олигонуклеотидов), в электродный буфер и в гель добавляют мочевину, выполняющую роль денатурирующего агента. При разработке этих систем гель-электрофореза было отмечено, что длина нуклеотидной последовательности, поддающейся прочтению непосредственно с помощью электрофореграммы, определяется разрешающей способностью метода электрофореза, которая в свою очередь зависит от толщины геля. В случае гелей толщиной 1—2 мм на радиоавтограмме обнаруживаются диффузные полосы, поскольку радиоактивный источник (фрагменты ДНК) весьма удален от поверхности рентгеновской пленки. Более тонкие гели (0,1—0,4 мм) позволяют достичь очень высокого разрешения олигонуклеотидов и обладают к тому же дополнительным преимуществом, которое заключается в том, что за счет тепла, выделяющегося в ходе электрофореза, происходит полная денатурация петель, обогащенных G -парами [129, 135]. [c.191]

В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу на четырех соседних дорожках в акриламидном геле в денатурирующих условиях затем проводят радиоавтографию, и фрагменты, содержащие радиоактивную метку, оставляют отпечатки на рентгеновской пленке. По их положению можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание — его положение. Так, по набору полос на рентгеновской пленке определяют нуклеотидную последовательность анализируемого фрагмента ДНК. [c.30]

При электрофорезе в полиакриламидном геле заряд белков не играет решающей роли в определении подвижности данной макромолекулы — особенно при электрофоретическом разделении кислых белков, обычно диспергированных в 0,1%-ном растворе додецилсульфата натрия. В этих условиях основные группы белка образуют комплексы с додецилсульфатом натрия и благодаря этому белки, подобно нуклеиновым кислотам, ведут себя главным образом как полианионы. Разделение в этом случае происходит в основном за счет различий в молекулярных весах, причем более мелкие компоненты движутся впереди более крупных. Путем стандартизации таких гелей с помощью белков или нуклеиновых кислот известного молекулярного веса можно с достаточной точностью определить молекулярный вес неизвестных компонентов [435]. Следует особо отметить, что если исследуемый белок состоит из двух или большего числа цепей, связанных друг с другом дисульфидными связями, и если разделение при этом проводят, как обычно, в присутствии сильных денатурирующих и восстанавливающих агентов, то полученные данные относятся к молекулярным весам структурных субъединиц или даже пептидных цепей. [c.62]

Молекулы с одноцепочечными разрывами денатурируют и разделяют методом электрофореза [c.142]

Рис. 9.17. Метод Саузерна. Молекулы ДНК обрабатывают рестриктазами и образовавшиеся фрагменты подвергают электрофорезу в агарозном геле. Размеры рестрикционных фрагментов определяют по фотографиям геля, окрашенного бромистым этидием. Затем фрагменты денатурируют и переносят на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги. Фрагменты ДНК

Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 500000 фрагментов длиной от 10 до 10 нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза в агарозе, после чего ДНК денатурируют щелочью прямо в геле, чтобы получить одноцепочечные фрагменты. Их переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируют высушиванием при 80°С. В результате получается отпечаток (реплика) картины разделения фрагментов ДНК по их размеру. Эти фрагменты можно идентифицировать методом гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами, специфичными для определенных генов или хромосом. Любой фрагмент, содержащий всю последовательность зондируемого гена или его часть, будет выглядеть на радиоавтографе в виде темной полосы (рис. 4.60). [c.126]

В качестве рабочего буфера геля использовали 0,1 М Na-фосфат (pH 7) с и,1% цетавлона. Белковый препарат перед электрофорезом денатурировали в течение 1 мин на кипящей водяной бане в том же буфёре, но содержащем 0,5% цетавлона и 10—15% i -меркаптоэтанола. Лидирующий краситель — малахитовый зеленый. Электрофорез в 10%-ном ПААГ при силе тока 8 мА на трубку (10X0,6 см) занимал около 5 ч. Белки фиксировали в кипящей 10%-ной ТХУ, затем окрашивали при комнатной температуре 0,57о-ным раствором СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% этанола, в течение 10 ч. [c.86]

Первый этап анализа связан с идентификацией этого гена в суммарной человеческой ДНК. Для этого ДНК выделяют из клеток, с помощью эндонуклеаз получают фрагменты, раздечяют их в агарозе с помощью гель-электрофореза, денатурируют на две отдельные цепи и создают реплику с препарата на питроцеллюлозном фильтре. Следующий шаг состоит в том, чтобы найти среди всех фрагментов р-глобиновый ген. Для этого необходим радиоактивный ДНК-зонд. Его синтезируют на р-глобиновой РНК с помощью обратной транскриптазы. Далее этот к-ДНК зонд используют для двух задач. Первое — идентифицировать фрагменты [c.70]

Н выделяют из клеток в осн. с помощью ультрацентри-ф>тиро вания и гель-электрофореза, избегая денатурирующих воздействий. [c.304]

Полное аналитическое разрешение всех рибосомных белков достигается с помощью двумерного гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Удобная система разделения была предложена Э. Кальт-шмидтом и Г. Виттманном они использовали 8%-ный полиакриламидный гель при pH 8,6 для электрофореза в первом направлении и 18%-ный гель при pH 4,6 во втором направлении. В этих условиях разделялись все белки 30S субчастицы и все белки 50S субчастицы Е. oli. Пример такого разделения белков обеих рибосомных частиц в слегка модифицированной системе дан на рис. 53 и 54. Первое направление электрофореза в рыхлом геле при нейтральном или слегка щелочном pH обеспечивает движение кислых и нейтральных белков влево, к аноду, в то время как основные белки мигрируют вправо, к катоду, разделяясь в основном по заряду. Второе направление электрофореза в плотно сшитом геле при кислом pH обеспечивает движение всех белков в одну сторону —к катоду (вниз), и в их разделение большой вклад вносит размер разделяемых компонентов (чем меньше, тем подвижнее). [c.91]

Рис. 20.22. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SS P). Препараты ДНК, различающихся одной парой нуклеотидов (А Т G ), амплифицируют ПЦР-методом с использованием одинаковых праймеров (Р1, Р2). ПЦР-продукты денатурируют и разделяют с помощью гель-электрофореза на двух дорожках (1, 2). Расстояние, на которое перемещается одноцепочечная молекула ДНК, зависит от ее конформации, а последняя, в свою очередь, — от нуклеотидной последовательности. Даже если ДНК различаются лишь одним нуклеотидным сайтом, одиночные цепи могут иметь разную конформацию, а следовательно, ПЦР-продукты образуют в геле не две, а четыре полосы.

Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты Е. oli имеет молекулярный вес 109 000 и состоит, вероятно, только из одной полипептидной цепи [59]. Это заключение основано на следующих фактах а) наблюдается отсутствие изменения молекулярного веса после разворачивания полипептидной цепи в растворе 6М гуанидингидрохлорида с 0,ЗМ -меркаптоэтанолом б) обнаружен только один N-концевой остаток метионина в) в присутствии денатурирующих агентов обнаружена только одна зона при электрофорезе в полиакриламидном геле. Насколько нам известно, еще не найден какой-либо другой фермент или белок, имеющий одну-единственную полипептидную цепь с молекулярным весом выше 100 000. Однако молекулы ферментов, состоящие из нескольких полипептидных цепей более высокого молекулярного веса, все же существуют (например, -галактозидаза Е. oli и миозин [60]). [c.396]

В современных методиках выделения ДНК (обзоры — см. ) основной стадией является обычно экстракция биологического материала фенолом 9. При этом ДНК после разделения слоев переходит в водный слой или остается в виде осадка в интерфазе, а большая часть белка денатурирует и переходит в фенольный слой. Для удаления белка из препаратов ДНК используют также обработку детергентами смесью хлороформ — изоамиловый (или октиловый) спирт а также инкубацию с протеолитическими ферментами, например с проназой РНК отделяют от ДНК фракционным осаждением спиртом и обработкой препарата рибонуклеа-зами. Большая часть полисахаридов обычно удаляется при фракционном осаждении этанолом или изопропанолом в некоторых случаях приходится применять дополнительную очистку (экстракция метилцеллозольвом, фракционирование цетавлоновых солей, электрофорез). [c.29]

Электрофорез в производственных условиях до сих пор не привился причиной этого, возможно, является сравнительно невысокая производительность существующих приборов и трудность обработки больших количеств материала. Фракционирование с помощью ионов тяжелых металлов сравнительно опасная операция, вследствие сильного денатурирующего действия подобных солей, и поэтому — трудности, сложности, опасности их применения в заводских условиях. Диализ, хотя и довольно часто используется, как правило, вызывает нарекания, является неудобной и нежелательной операцией в большинстве производств, где он введен. Все же существуют недавно предложенные конструкции автоматических проточных диализационных приборов, специально разработанных для промышленности. Процесс в них [c.156]

Мы исследовали водорастворимую фракцию белков клубней картофеля. Как известно, ткани картофеля содержат значительное количество фенольных веществ, которые неблагоприятно действуют на белки, осаждая и денатурируя их. Поэтому мы вынуждены были принимать меры к устранению такого действия. Удовлетворительные результаты в этом направлении дало применение аскорбиновой кислоты в качестве составной части буферного раствора трис (оксиметиламинометан) — 18,41 г аскорбиновая кислота — 10 г версен (этилендпаминтетраацетат) — 40. иг вода — до 1 л рП 8,6. Ткани клубней растирали в ступке и экстрагировали указанным буферным раствором в отношенпи 1 4 на холоду (5° С) при постоянном помешивании в течение 30 мин. Экстракт центрифугировали и пропускали через сефадекс Г-25 (насыщенный тем же буферным раствором) для освобождения от низкомолекуляриых веществ. Собирали фракцию, содержащую белок, наличие которого определяли по реакции осаждения с 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты. К полученному раствору белка прибавляли сернокислый аммоний до 75% насыщения и оставляли в холодильнике на 1 час. Затем смесь центрифугировали и осадок растворяли в воде, после чего раствор пропускали через сефадекс Г-25 (насыщенный водой) для освобождения от соли. Собирали содержащую белок фракцию, которую высушивали лиофильно. Дальнейшее исследование полученных препаратов проводили методом электрофореза в синтетп-ческом полиакриламидном геле. Следует отметить, что полиакриламидный гель имеет ряд преимуществ перед другими носителями, применяемыми для электрофореза постоянные свойства [c.73]

При хроматографии и электрофорезе белков использование органических растворителей исключается из-за их денатурирую щего действия, в результате которого белки переходят в нерастворимое сйстояние. Подобное действие могут оказывать и некоторые органические соединения. Поэтому при разделении белков необходим тщательный выбор селективных водных буферных систем. Однако необходимость солюбилизации белков, в особенности тех из них, которые ассоциированы с биологическими мембранами, привела к введению детергентов — как ионных, так и неионных, а также таких реагентов, как мочевина и гидрохлорид гуанидина, которые разрывают водородные связи и препятствуют гидрофобным взаимодействиям. Даже будучи денатурированными, многие белки остаются растворимыми в присутствии этих соединений, особенно после расщепления ди-сульфидных связей дитиотретиолом или меркаптоэтанолом. [c.105]

Сложные смеси РНК, имеющих одинаковую молекулярную массу, но различную нуклеотидную последовательность, можно разделить с помощью электрофореза в градиенте концентрации денатурирующего агента. Возможности этого метода продемонстрированы Гроссом и др. [88] на примере электрофоретического фракционирования гистоновых мРНК морского ежа в гелях, содержащих мочевину (рис. 10.6). Мочевина оказывает дестабилизирующее действие на систему внутримолекулярных водородных связей, а при низких значениях pH способствует протонированию остатков аденозина и цитозина. Поэтому по мере увеличения концентрации мочевины все более четко проявляется зависимость величины заряда молекул РНК от их нуклеотидного состава и размеров, и эта зависимость находит отражение в изменении подвижности молекул РНК в ходе их электрофоретического разделения. [c.179]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Не меньшей популярностью пользуется в настоящее время и метод электрофореза в полиакриламидном геле. Добавляя к раствору акриламида, налитому в стеклянные трубки, различные количества мономеров (например, метиленбисакриламид, этилендиакрилат), образующих в процессе полимеризации поперечные сшивки, можно получить гели с различной степенью связанности [137, 404]. Устойчивость к денатурирующим растворителям, например к 8 М раствору мочевины или 1 %-ному раствору додецилсульфата натрия, составляет еще одно важное преимущество этих гелей. При наложении разности потенциалов белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и вирусы передвигаются в этих гелях на характерные расстояния, которые зависят главным образом от их молекулярного веса (или веса частицы), а также от степени связанности сшивок геля. Разделившиеся вещества образуют характерные полосы, которые можно выявить либо с помощью методов окрашивания или локального осаждения, либо (в случае разделения радиоактивных веществ) с помощью метода радиоавтографии (см. гл. XI, разд. Б). Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле такова, что с помощью этого метода можно обнаружить и идентифицировать приблизительно 37 видов рибосомных белков [508]. То, что разделение белка на многочисленные полосы происходит в силу действительного различия между белками, а не в результате каких-то артефактов, теперь уже не вызывает солшений. Однако известно, что разделяться на отдельные полосы могут не обязательно совершенно различные вещества, но и такие близкие между собой вещества, как, например, один и тот же белок, у которого часть молекул содержит одну лишнюю амидную (— СО — NH2 С00 ) группу, а другая часть — ацетильную (—NH+— NH — СОСН3) группу [136]. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле [c.61]

Таким образом, число сульфгидрильных и дисульфидных групп в яичном альбумине точно не известно. Вероятно, присутствует 4 или 5 сульфгидрильных и 1 или 2 дисульфидпые группы. Разные результаты, которые были получены отдельными группами исследователей, по-видимому, могли быть обусловлены тем фактом, что существуют две формы нативного яичного альбумина, отличающиеся по скорости денатурации нагреванием при pH 3 и по некоторым другим показателям. Труднее денатурирующаяся форма образуется в белке яйца из более легко денатурирующейся формы по мере старения яйца [45—47]. Другая возможная причина несовпадения результатов заключается в гетерогенности белка, которая проявляется при электрофорезе на крахмальном геле [48]. Этим методом можно обнаружить до шести фракций точное число и подвижность различных фракций альбумина, по-видимо-му, генетически детерминированы. Причина этой гетерогенности, помимо того, что она обусловлена различным содержанием фосфора (раздел 7), в настоящее время неизвестна. [c.12]

Экспериментальные данные о процессах перегруппировки генов, кодирующих константные и вариабельные участки иммуноглобулиновых цепей, были получены с помощью методов, основанных на применении рекомбинантных ДНК. Для этого из фракции полисом выделяли мРНК, кодирующую L-цепь миеломы, на ее основе с помощью обратной транскриптазы получали кДНК, которую клонировали на плазмид-ном векторе. Наработанную в значительных количествах клонированную кДНК расщепляли подходящей рестриктазой таким образом, чтобы получить два фрагмента, соответствующих V- и С-участкам L-цепи. Фрагменты ДНК разделяли препаративно с помощью электрофореза, вводили радиоактивную метку с помощью ник-трансляции, денатурировали и использовали в качестве зондов для идентификации фрагментов рестрикции ДНК из миеломных или эмбриональных клеток, содержащих последовательности, комплементарные последовательностям зондов. Наиболее существенно, что, как показано на рис. 16.22, в ДНК клеток миеломы оба V- и С-кодирующих участка локализуются на одном и том же со RI-фрагменте, в то время как в эмбриональной ДНК они находятся на различных Есо RI-фрагментах. Это означает, что на каком-то этапе развития между эмбриональной клеткой и дифференцированным лимфоцитом происходит специфическая перестройка ДНК, которая в данном случае привела к удалению Есо RI-сайта (или сайтов), находившегося в рамках протяженной области ДНК между V- и С-ко-дирующим участками в эмбриональной ДНК. После такой перестройки эти участки оказались расположенными в непосредственной близости друг к другу. Комбинация генов L-цепи, возникшая при их перегруппировке в ходе дифференциации лимфоцита, при его последующем митотическом делении устойчиво наследуется дочерними клетками. [c.241]

Существует несколько методов выявления криптических различий между белками, не обнаруживаемых посредством обычного электрофореза. Один из этих методов, получтший название последовательного электрофореза, состоит в электрофоретической разгонке одних и тех же образцов в различных условиях, например с использованием различных буферов или различных концентраций геля (рис. 22.12). При другом методе образцы ткани или ферменты подвергаются действию высокой температуры или некоторых других денатурирующих агентов, например обрабатываются мочевиной. В результате один из двух электрофорети-чески неразличимых белков может денатурировать, а второй-остаться [c.97]

Сильным ионным детергентом типа ДСН можно солюбилизировать даже самые гидрофобные белки мембран. Это позволяет анализировать такие белки методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Разработка данной методики произвела настоящую революцию в изучении мембранных белков. Детергенты такого типа разворачивают (денатурируют) полипептидиую цепь белка, внедряясь в его внутреннее гидрофобное ядро (см. рис. 3-22). Обычно при этом белки утрачивают активность и становятся непригодными для исследования их функции. Тем не менее белки могут быть легко очищены в денатурироваппой под действием ДСН форме. В некоторых случаях удаление детергента приводит к ренатурации и восстановлению функциональной активности. [c.362]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология