Сахароза, градиент плотности

Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез. [c.145]

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Наиболее широкое применение нашел метод изоэлектрической фокусировки. Он основан на создании под действием внешнего электрического поля стабильного градиента pH, причем значение pH возрастает от анода к катоду. В такой системе каждый белок перемещает в том или ином направлении в соответствии со знаком своего заряда до тех пор, пока не достигнет участка, в котором значение pH совпадает с его изоэлектрической точкой. На этом участке дальнейшее его перемещение под действием электрического поля прекращается, так как его заряд становится равным нулю. Приложенное поле, поддерживающее стабильный градиент pH, препятствует также диффузному размыванию зоны. Механизм аналогичен только что рассмотренному эффекту градиента плотности раствора сахарозы на стабилизацию зон при седиментации. Действительно, если в результате диффузии белок уходит из участка, на котором pH = р1, в сторону катода, он попадает в область более высоких значений pH и заряжается отрицательно. Под [c.243]

Осторожным наслаиванием растворов сахарозы с последовательно уменьшающейся плотностью или центрифугированием растворов, содержащих кроме исследуемых веществ равномерно распределенные по объему пробирки соли цезия или рубидия, можно создать градиент плотности растворителя по высоте пробирки. Центрифугирование в ячейках с градиентом плотности приводит к накоплению вещества в очень узкой области, в которой плотность вещества совпадает с плотностью растворителя. Центрифугирование в градиенте плотности применяется, в частности, при изучении нуклеотидов. [c.157]

В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ САХАРОЗЫ [c.172]

Для грубого предварительного разделения клеточных фрагментов достаточно кратковременного последовательного центрифугирования при нескольких разных скоростях (с разным центробежным ускорением) (разд. 3.1. а). Однако, чтобы получить максимально чистые препараты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиенте плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций, различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора сахарозы (от 25% на дне до 5% на поверхности). Затем сверху аккуратно наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разделяется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируемых градиентом сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и собирают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций. Далее определяют положеиие каждой фракции и содержание в ней РНК. [c.163]

При достаточно большом времени центрифугирования частицы достигают в градиенте плотности равновесных положений. Именно та-[ким образом в соответствии с их плотностью в градиенте сахарозы разделяют клеточные органеллы (гл. 1, разд. Б.6). Макромолекулы (на- [c.163]

Следует также упомянуть метод центрифугирования в градиенте плотности. Обычно работают в возрастающем градиенте плотности сахарозы при высокой скорости ротора. Расстояние, на которое перемещается белок в градиенте, обратно пропорционально его молекулярной массе. Молекулярную массу неизвестного белка с достаточной точностью можно определить, сравнивая его с добавленным стандартным белком известной молекулярной массы. [c.361]

Хотя в настоящее время существуют методы определения изоэлектрической точки исследуемых белков с достаточной точностью (например, изоэлектрическое фокусирование в градиенте плотности сахарозы), знание изоточки вовсе не обязательно для выбора ионообменника. Пригодность того или иного ионита легко определить по степени связывания белка в статических условиях. В случае анионита смолу приводят в равновесие с буферным раствором, pH которого соответствует верхней границе области устойчивости исследуемого белка. В случае катионита pH буфера будет соответствовать нижней границе этой области. Обессоленный белок растворяют в соответствующем буфере, осторожно (избегая вспенивания) перемешивают с порцией ионита, отделяют надосадочную жидкость. По концентрации белка в надосадочной жидкости судят о степени связывания его с соответствующим ионообменником. [c.431]

Разделение ДНК в градиенте плотности. Центрифугирование в щелочном сахароз- [c.892]

Затем через второй патрубок медленно (4 мл/мин) по стенке подают в колонку рабочий раствор, формируя при этом ступенчатый или плавный градиент плотности. При создании ступенчатого градиента в 33 нумерованные пробирки помещают по О, 0,1, 0,2... 3,2 мл разбавленного раствора сахарозы с амфолитами и по 3,2, 3,1, 3,0, 2,9... О мл концентрированного раствора сахарозы. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и поочередно, вручную или с помощью перистальтического насоса, вносят в рабочую камеру. [c.307]

Существенным недостатком электрофокусирования в градиенте плотности является трудность детектирования амфолитов-образцов в присутствии амфолитов-носителей и сахарозы. Наиболее удобным методом обнаружения служит определение ферментативной активности. Правда, амфолиты-носители могут [c.313]

Для фракционирования ферментов в градиенте плотности Веллер [60] использовал чрезвычайно простой по конструкции прибор, в основу которого положена ячейка, приведенная на рис. 7. Электрофокусирование проводят в правой части объемом II мл. Непосредственно под рабочим раствором и в левом, уравновешивающем плече находится катодный электролит, содержащий 40% сахарозы. Для заполнения ячейки 14 мл катодного электролита помещают в и-образную трубку, а затем в рабочей камере последовательно наслаивают И фракций по мл, причем разница при замене концентрированного раствора разбавленным составляет 0,1 мл. Катод погружают в левую камеру, а анод — в правую предварительно поверх рабочего раствора наслаивают 1— [c.318]

Б. Разделение тех же РНК путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и сбора проб в пробирки, как указано в подписи к фпг. 8. [c.41]

При длительном ультрацентрифугировании концентрированных растворов низкомолекулярных веществ (обычно хлористого цезия или сахарозы) в кювете устанавливается стационарный градиент плотности. Макромолекулы, присутствующие в растворе, локализуются при этом в той области кюветы, где плотность раствора равна плотности этих макромолекул. В случае гомогенного вещества измерение ширины полосы позволяет определить молекулярный вес (см. стр. 137) [c.70]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Методы выделения РНК (обзоры — см. в общем, довольно близки к методам выделения ДНК. Экстракцию клеток или субклеточных частиц для получения РНК проводят обычно фенолом остаточный белок часто удаляют обработкой детергентом или смесью хлороформа с октиловым спиртом. Отделение ДНК от РНК происходит обычно на стадии экстракции, так как можно подобрать условия, в которых РНК переходит в водный слой, а ДНК остается в интерфазе. Часто применяют для этой цели фракционное осаждение, реже — обработку препарата ДНК-азой. Различные типы клеточной РНК могут быть разделены фракционным осаждением, центрифугированием в градиенте плотности сахарозы методами хроматографии и электрофореза в геле [c.36]

Образование градиента плотности. Существует много методов создания градиентов концентрации самого разнообразного вида (см., например, [14, 15]). Для электрофореза обычно применяют постоянный градиент плотности, для чего необходимо создать линейно меняющуюся с высотой концентрацию сахарозы в столбике жидкости подходящих размеров. Можно, например, просто аккуратно налить друг па друга слои жидкости с уменьшающейся концентрацией сахарозы. Если толщина слоев невелика, ступеньки постепенно сглаживаются диффузией можно [c.66]

Мы будем иногда для определенности считать, что градиент плотности создается добавлением сахарозы, хотя, как будет сказано ниже, для этой цели часто используют и другие вещества. [c.66]

В начальный момент сама зона не стабилизирована градиентом плотности, но если она узка (порядка нескольких миллиметров), то через несколько минут внутри зоны возникает градиент плотности благодаря диффузии сахарозы. Поэтому рекомендуется перед включением тока выждать некоторое время (порядка 15 мин). [c.68]

Движение зоны. Изменение состава жидкости по высоте ячейки влечет за собой изменение других свойств. Так, при использовании градиента сахарозы с глубиной растет вязкость, что приводит к уменьшению подвижности ионов, уменьшению электропроводности и увеличению напряженности поля. Возрастание напряженности лишь частично компенсирует уменьшение подвижности крупных ионов (например, белка), так как последняя сильнее зависит от вязкости. В результате движение нисходящих зон постепенно замедляется, а восходящих — ускоряется по мере их перемещения. Эту нелинейность можно скомпенсировать и даже изменить ее знак, создавая вместе с градиентом плотности градиент электропроводности в ячейке. Для этого в смеситель заливают растворы, отличающиеся не только плотностью, но и электропроводностью. Такую возможность удобно использовать при разделении сложных смесей с различными соотношениями подвижностей компонентов. Если, например, разделяется смесь трех веществ с соотношением подвижностей 1 2 4, то расстояния между зонами при равномерном движении будут относиться [c.68]

Седиментация под влиянием центрифугирования происходит при скорости, зависящей от размера капель эмульсии. Пинтер и Зильвесмит (1962) фракционировали эмульсии М/В по размерам частиц седиментацией в колонке с сахарозой. Они получали слои с различными плотностями. Градиент плотности создавали при смешивании 50 и 30% растворов сахарозы. Смесь помещали в пробирку емкостью 100 и далее вводили 1 мл эмульсии М/В в 50% растворе сахарозы. В нижнюю часть пробирки вводили 5 мл 60% раствора сахарозы. Центрифугирование проводили при скорости до 2800 об1мин. [c.153]

ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ, метод разделения и анализа амфотерных в-в, гл. обр. белков, в электрич. поле в среде с изменяющимся в определ. направлении pH. В-ва при зтом смещаются к катоду или аноду до тех пор, пока каждое из них не достигнет зоны, pH к-рой совпадает с его изоэлектрич. точкой, и не сконцентрируется в ней ( фокусирование ). Градиент pH создают, помещая в электрич. поле смесь амфолитов с широким набором изоэлектрич. точек, напр, смесь полиаминов, замещенных в разл. степени карбоксиалкильными группами (т. н. амфолинов). Для стабилизации градиента разделение проводят в вертикальных колонках с градиентом плотности, наполненных сахарозой или глицерином, либо в слоях гелей (полиакриламида, се-фадексов). Метод обладает высоким разрешением и примен. для выделения и очистки от десятков миллиграммов до неск. граммов белков, идентификации (неск. мкг) и анализа их сложных смесей и т. д. [c.216]

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фоьсусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в ввде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая [c.32]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Для биофизики важен метод седиментации в градиенте плотности. В концентрированном растворе низкомолекулярного но-щества (в СзС1, в сахарозе и т. д.) при ультрацентрифугироиа-нии устанавливается градиент концентрации, т. е. градиент плотности растворителя макромолекул фо/йх. В таком растворе мак[)о-молекулы будут располагаться в той части кюветы, в которой 5 = 0, т. е. согласно (3.66), Умро = 1 или ро = рм- Иными словами, макромолекулы локализуются в той области кюветы, где плотность концентрированного раствора совпадает с плотностью макромолекул (р измеряется непосредственно). Гетерогенная смесь макромолекул разделяется и наблюдается спектр плотностей. Этот метод с большой эффективностью применяется при изучении нуклеиновых кислот. [c.82]

Для идентификации гена, кодирующего протоксин, используют обычную методику. В. thuringiensis выращивают в культуре и лизируют клетки. Выделяют суммарную клеточную ДНК и центрифугируют ее в градиенте плотности s l, чтобы разделить плазмидную и хромосомную ДНК. Если гены протоксинов входят в состав генома, создают банк клонов хромосомной ДНК. Если же они содержатся в плазмиде, то плазмидную ДНК фракционируют по размерам центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Это обогащает ту плазмидную фракцию, которая послужит в дальнейшем исходным материалом для идентификации генов протоксинов (рис. 15.3). [c.335]

Ген протоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki находится на одной из семи плазмид длиной 2,0 7,4 7,8 8,2 14,4 45 и 71 т. п. н. Чтобы определить, в какой именно, проводили центрифугирование плазмидной ДНК в градиенте плотности сахарозы. Были вьщелены три фракции, в кото- [c.335]

Важной разновидностью седимеита-ционного метода, получившей широкое применение при исследовании природных полимеров, является центрифугирование в градиенте плотности [3, с. 418]. В центрифужной пробирке создают градиент плотности (например, смёшивая при помоши автоматически действующих насосов водный раствор сахарозы с водой в постепенно уменьшающихся соотношениях), а затем наслаивают поверх него исследуемый раствор полимера в легком растворителе (рис. 169). [c.544]

Технология получения гемагглютинина из гриппозных вирионов заключается в следующем накопленный вирусный материал в аллантоисной жидкости куриного эмбриона сепарируют, подвергают микрофильтрации и фильтрационному концентрированию примерно в 50 раз, при необходимости дополнительно очищают ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы концентрированный вирионный материал обрабатывают катионным ПАВ и отделяют гемагглютинины ультрафильтрацией с последующими диализом и стерилизующей фильтрацией. На последней стадии стандартизируют и контролируют с ъединичную вакцину (особенно — на отсутствие живых гриппозных вирусов). [c.486]

Гель-фильтрацию проводят на сефадексе G-200 в указанном рабочем растворе, что дает двукратное увеличение удельной активности. Ультрацентрифугирование проводят в градиенте плотности сахарозы (30 мл 25%-ного раствора МаСЦ-0,1 М орнитин [c.17]

Лизосомы (диаметр 200—600 ммт меньше по размерам, чем митохондрии, от которых их можно отделить при помош,и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [104, 222]. Они служат вместилищем высокоактивных гидролитических ферментов, в том числе рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, фосфатаз, катеп-сипов, гликозидаз и сульфатаз. [c.133]

Для седиментационных экспериментов удобной средой является забу-ференный раствор сахарозы с линейным градиентом плотности (обычно между 5 и 20%). Такой градиент можно создать в центрифужных пробирках до начала работы при помощи простого аппарата для перемешивания. В ряде случаев вместо сахарозы используют самообразующийся градиент плотности хлористого цезия. Седиментацию вещества в градиенте плотности можно регистрировать непрерывно при помощи ультрафиолетовой оптики, которой снабжена аналитическая центрифуга. Вместо этого можно также просто прокалывать дно пробирки или отбирать пробы с помощью сифона, опущен-в ого до самого дна пробирки. Отобранные пробы собирают в отдельные пробирки на коллекторе фракций. Концентрацию вещества в каждой из фракций определяют по поглощению света (в ультрафиолетовой области при 260 ммк), по реакционной способности (содержание дезоксирибозы), по биологической активности, по содержанию определенной радиоактивной метки (например, Р ) и т. д. [c.138]

Для определения молекулярного веса ДНК (обзоры — см. наиболее широко используются методы, основанные на определении скорости седиментации макромолекул. Это определение может быть выполнено по различным методикам наиболее широкое распространение в последнее время приобрела методика, основанная на зональном центрифугировании в градиенте плотности сахарозы в препаративной ультрацентрифуге В данном случае распределение веществ по скорости осаждения можно контролировать по радиоактивной метке, что обеспечивает высокую чувствительность с другой стороны, методика практически без изменений может быть применена и для препаративного разделения нуклеиновых кислот. Предложен ряд эмпирических уравнений, связывающих скорость седиментации двухцепочечного комплекса ДНК со значением молекулярного веса определенным независимыми методами. Последнее из этих уравнений охватывает пределы мол. веса 0,2— 130 108. [c.30]

Стабилизирующее действие градиента плотности. Электрофорез с применением градиента плотности проводится в вертикальной трубке, в которую предварительно налит буферный раствор с плотностью, возрастающей с глубиной. Это достигается добавлением какого-либо тяжелого недиссоциирующего вещества (чаще всего сахарозы) с переменной концентрацией. [c.65]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология