Олигонуклеотидный мутагенез

Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидных праймеров [c.163]

За более чем столетнюю историю изучения о ДНК накоплена масса сведений, часть из которых нашли свое отражение в данной брошюре. Наибольшее внимание уделено результатам исследований последних десятилетий, ставших возможными благодаря открытию двойной спирали ДНК, разработке методов клонирования, секвенирования, олигонуклеотидного синтеза, сайт-направленного мутагенеза, полимеразной цепной реакции, за которые в разные годы были присуждены Нобелевские премии. Приводятся подходы и перспективы дальнейшего изучения и использования молекул ДНК в различных отраслях науки и человеческой деятельности. [c.2]

В настоящее время химический синтез замещенных белков из природных аминокислот вытеснен методом олигонуклеотидного мутагенеза (см. выше). Химические методы применяют, только если требуется замещение необычной аминокислотой. Детально эта область рассматривается в обзоре [9] и книге Оффорда [35]. [c.111]

Свойства любого белка зависят от его конформации, которая в свою очередь определяется аминокислотной последовательностью. Некоторые аминокислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка, так что замена единственного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в него аминокислоты, приводящему к понижению его активности, либо, напротив, к улучшению каких-то его специфических свойств. С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил название направленного мутагенеза. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага M13. Одноцепочечную форму ДНК этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного таким образом, чтобы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотид. Затем трансформируют двухцепочечными ДНК M13 клетки Е. соИ. Часть образующихся в клетках фаговьгх частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его активность. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР. Обычно заранее не известно, какую [c.175]

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы — субтилизина они применили метод химической мо дификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы химической модификации не только жестки и неспецифичны они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществляется при помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, сайт-специфический мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подх.одящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти — пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов. [c.183]

Очень важной модификацией метода является гибридиза-ционный скрининг с радиоактивно меченным олигонуклеотидом, который применяется для мутагенеза. В данном случае этот олигонуклеотид служит зондом. Показано, что прочность гибридов сильно различается из-за того, что при гибридизации олигонуклеотид-зонд полностью комплементарен мутантной форме ДНК, а дикой форме ДНК одна пара оснований не комплементарна. На практике переносят отпечатки негативных колоний с чашки Петри на нитроцеллюлозный фильтр, проводят гибридизацию с олигонуклеотидным зондом при условиях, когда гибри-дизуются обе формы ДНК. Затем фильтр последовательно промывают при все более высокой температуре. Можно, таким образом, подобрать условия, при которых на радиоавтографе фильтра зоны почернения будут отвечать только мутантным формам ДНК. Этот метод особенно ценен тем, что позволяет изолировать мутации без их фенотипического проявления. [c.162]

Однако, для того чтобы все существующие в M S сайты узнавания гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз были пригодны для использования их в качестве сайтов для молекулярного клонирования, необходимо, чтобы они были уникальными, т.е. не встречались больше в остальной последовательности вектора. Кроме действительно изначально уникальных, для некоторых ферментов имелись дополнительные участки узнавания в других местах векторной молекулы. Первые векторы, как семейства одноцепочечных фаговых векторов М13тр, так и семейства pU , подвергали химическому мутагенезу с целью изменения отдельных нуклеотидов в нежелательных сайтах узнавания тех или иных рестрикционных эндонуклеаз и в результате кропотливого анализа отбирали требуемые варианты. В последующем, с появлением и разработкой метода сайтнаправленного мутагенеза, осуществляемого с помощью специально синтезированного олигонуклеотидного праймера, несущего измененный неспариваемый нуклеотид, процедура удаления ненужных сайтов узнавания рестрикционных эндонуклеаз существенно упростилась. [c.217]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология