Олигонуклеотидный синтез

По мере разработки методов олигонуклеотидного синтеза, по-видимому получит развитие другая стратегия, основанная на синтезе двуспиральных фрагментов, содержащих измененную пару оснований (рис. 30, II). Из-за необходимости синтеза двуспиральных олигонуклеотидов метод становится более трудоемким кроме того, возможны осложнения, связанные со встав- [c.162]

За более чем столетнюю историю изучения о ДНК накоплена масса сведений, часть из которых нашли свое отражение в данной брошюре. Наибольшее внимание уделено результатам исследований последних десятилетий, ставших возможными благодаря открытию двойной спирали ДНК, разработке методов клонирования, секвенирования, олигонуклеотидного синтеза, сайт-направленного мутагенеза, полимеразной цепной реакции, за которые в разные годы были присуждены Нобелевские премии. Приводятся подходы и перспективы дальнейшего изучения и использования молекул ДНК в различных отраслях науки и человеческой деятельности. [c.2]

А. Синтез пары олигонуклеотидных зондов [c.197]

Синтез олигонуклеотидного зонда [c.469]

Как видно из материала предыдущего раздела, задача установления первичной структуры нуклеиновых кислот является весьма сложной и разрешена пока лишь в некоторых простейших случаях. В связи с этим большое значение для исследований связи структуры и реакционной способности, а также биологической активности приобретают модельные олиго- и полинуклеотиды определенного строения. Некоторые полинуклеотиды такого типа (см. стр. 64) получены из природных объектов, однако систематическое использование модельных полинуклеотидов для решения физико-химических и биологических проблем стало возможным только после разработки методов препаративного получения подобных соединений с помощью химического или ферментативного синтеза. Химические методы синтеза имеют значение для получения олигонуклеотидных соединений для получения же полинуклеотидов применяются ферментативные и химико-ферментативные методы. [c.83]

Использованные для ферментативной реакции олигонуклеотидные фрагменты 1—4 были получены химическим синтезом. Можно использовать для частичного синтеза подобных полинуклеотидов и ферментативную полимеризацию. Так, полинуклеотид, содержащий фрагменты 1 и 2, мол<ет быть достроен до двухцепочечного комплекса полинуклеотида ХС1 действием ДНК-полимеразы и смеси дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов [c.103]

При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующие интересующий нас участок ДНК процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой (рис. 1). Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы, протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. [c.176]

Олигонуклеотидные праймеры. Олигонуклеотидные праймеры должны иметь в длину 20—25 нуклеотидов, чтобы обладать достаточной специфичностью. После синтеза следует очистить их при помощи электрофореза и хранить в ТЕ-буфере в концентрации 10 пмоль/мкл при 20°С. [c.143]

Произошедшее изменение химии синтеза вместе с сопровождавшим его процессом автоматизации и использованием полимерных носителей в виде твердой фазы довершили начатое дело и привели к егце более широкому вовлечению олигонуклеотидов в молекулярно-биологические эксперименты. Здесь можно усмотреть некую аналогию природных процессов с только зарождавшимся в самом начале 60-х годов в ходе расшифровки генетического кода олигонуклеотидным синтезом и уже нынешним состоянием дел в этой области. И если мысленно егце раз вернуться к нашей пребиотической планете, то становится очевидным резкий скачок, который мог произойти при осугцествлении синтеза на тогдашних природных твердых фазах, потребовавший, однако, предварительной наработки мономеров для повышения их обгцей концентрации, необходимой для обеспечения эффективной полимеризации. Можно также предполагать, что с накоплением исходных мономеров, и затем полинуклеотидных молекул подобные процессы, вероятно, заметно ускорились, а с появлением у первых полимеров первичных каталитических свойств они стали идти во много раз быстрее. Так, в качестве примера практически несопоставимого по [c.12]

Продолжавгпееся на протяжении 70-х годов совершенствование химии синтеза олигонуклеотидов завершилось в начале 80-х революционным переходом к фосфорамидитному методу. Благодаря использованию данных высокореакционных соединений трехвалентного фосфора, скорость синтеза и его эффективность возросли настолько, что один цикл синтеза, занимавший прежде целый месяц, сократился до нескольких минут на звено, а конечный выход олигонуклеотидов приблизился к количественному. По существу, методология синтеза, пожалуй, больше не нуждается в каких-либо усовершенствованиях, полностью обеспечивая потребности молекулярных биологов и других исследователей в олигонуклеотидах заданной последовательности, дополнительным доказательством чему служит то, что олигонуклеотидный синтез в настоящее время с помощью автоматических синтезаторов ДНК способен осуществлять даже непрофессиональный химик. На плечи же высококлассных специалистов теперь легла задача по разработке методов синтеза различных модифицированных олигонуклеотидов и их производных, использование которых позволяет решать молекулярным биологам (и не только им) совершенно новые грандиозные задачи. Однако чтобы при данном изложении не сильно нарушать хронологический порядок развития исследований, связанных с ДНК, придется на время отойти от рассмотрения олигонуклеотидов и иже с ними и вернуться в лоно классической молекулярной биологии. [c.13]

Как уже отмечалось выше, методология олигонуклеотидного синтеза разработана настолько хорошо, что трудно ожидать какого-либо еще существенного прогресса в этой области. Однако, это относится, главным образом, к синтезу обычных олигонуклеотидов, которые после процедур очистки и ферментативного фосфорилирования от натуральной ДНК отличаются разве что размером. Что касается синтеза модифицированных олигонуклеотидов, то здесь имеется огромный простор для химиков-синтетиков по созданию все новых их вариантов. В то же время особенность синтеза модифицированных олигонуклеотидов заключается не в самом химизме реакций присоединения очередных мономеров в ДНК-синтезаторе, а, главным образом, в использовании соединений различной природы (выбор которых диктуется целым рядом причин и условий) при синтезе исходных фосфорамидитов. [c.61]

Эту последовательность реакций можно повторять, пока не будет синтезирована желаемая полипептидная цепь. Отметим, что на каждой стадии растущая полипептидная цепь переносится на олигонуклеотидный носитель, а после окончания синтеза оли-гонуклеотидный носитель отщепляют от нерастворимой матрицы. Олигонуклеотид, прикрепленный к полипептидной цепи, облегчит хроматографическую очистку полипептида, а затем его можно отщепить мягкой щелочной обработкой. [c.66]

В ходе Р. рост цеш1 осуществляется благодаря взаимод. дезоксирибонуклеозидтрифосфата с З -ОН концевым нуклеотидом уже построенной части ДНК при этом отщепляется ш1рофосфат и образуется фосфодиэфирная связь. Рост полинуклеотидной цепи (рис. 2) идет только с ее З -конца, т. е. в направлении 5 3 (см. Нуклеиновые кислоты). Фермент, катализирующий эту р-цшо,-ДНК-полиме-раза (см. Полидезоксирибонуклеотид-синтетазы)-пе способен начать матричный синтез на одноцепочечной ДНК, если нет хотя бы олигонуклеотидного биспирального участка (т. наз, затравочного ол ггонуклеотида) комплементарного матрице затравочным олигонуклеотидом во мн. случаях является не ДНК, а РНК. [c.252]

Расщепление химерных белков В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может использоваться как таковой или в составе химерного белка, причем последний вариант встречается нечасто. Например, из-за присутствия фрагмента хозяйского белка большинство химерных белков оказываются непригодными для применения в клинике, а сам продукт клонированного гена-мишени может оказаться неактивным. Кроме того, для химерных белков предусмотрена более сложная процедура тестирования, которую они должны пройти, чтобы получить разрешение к применению у соответствующих организаций. Все это заставляет искать способы удаления лишних аминокислотных последовательностей из молекулы получаемого продукта. Один из таких способов основан на присоединении белка, кодируемого геном-мишенью, к белку клетки-хозяина, содержащему короткий пептид, распознаваемый специфической протеазой небактериального происхождения. Такое присоединение тоже программируется на уровне ДНК. Олигонуклеотидные линкеры, несущие сайты для протеаз, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введена в экспрессирующую векторную систему слияния. Линкером может служить, например, олигонуктеотид, кодирующий пептид Пе-01и-01у-Аг . После синтеза и очистки химерного белка для отделения белкового продукта, кодируемого клонированным геном, можно использовать фактор свертывания крови Х , который является специфической протеиназой, разрывающей пептидные связи исключительно на С-конце последовательности Ile-Glu-Gly-Arg (рис. 6.6). Более того, поскольку такой пептид [c.112]

Рис. 8.5. Химический синтез олигонуклеотидных праймеров, содержащих в определенных сайтах разные нуклеотиды. В данном случае в сосуде с G-фосфо-рамидитом (94%) содержатся также фосфорамидиты А (2%), С (2%) и Т (2%), так что в результате реакции образуется смесь олигонуклеотидов, в которых в тех сайтах, где должен находиться G, присутствуют А, С или Т.

С разработкой в начале 80-х гг. быстрых, эффективных и недорогих методов химического синтеза олигонуклеотидов появилась возможность использовать радиоактивно меченные олигонуклеотидные зонды для выявления различий между нуклеотидными последовательностями, в частности для обнаружения мутаций у человека. К тому времени было изолировано относительно небольшое число генов, главным образом в виде комплементарных ДНК (кДНК), поэтому подбор зонда, гомологичного конкретному гену, представлял собой непростую задачу. Но даже если соответствующие кДНК были получены, невозможно было различить нормальный и мутантный гены чело- [c.189]

Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК L- и Н-цепей из клеточной линии гибридомы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ПЦР. В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5 - и 3 -концов последовательность, кодирующую вариабельную область. Зная нуклеотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (V и Vjj), легко определить границы DR, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные области относительно консервативны. Исходя из данных о нуклеотидных последовательностях ДНК, кодирующих DR грызунов, синтезировали шесть пар олигонуклеотидных праймеров. Каждая пара инициировала синтез ДНК, кодирующей одну из шести DR грызунов три, локализованных на L-цепи, и три - на Н-цепи. Кроме того, на 5 -конце каждого праймера находилось 12 дополнительных нуклеоти- [c.217]

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (Polymerase hain rea tion) Метод амплификации специфического сегмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-поли-меразы с использованием олигонуклеотидных ДНК-зондов, комплементарных последовательностям противоположных цепей ДНК, фланкирующим амплифицируемый сегмент. Процесс состоит из серии циклически повторяющихся реакций денатурации ДНК, отжига зондов, синтеза ДНК. [c.557]

Что касается материала для селекции, то получение огромного многообразия нуклеиновых кислот в виде смеси не представляет труда. Для этого достаточно провести синтез, используя на некотором числе этапов смесь всех четырех мономеров вместо индивидуальных мономеров. Это легко сделать на автоматах для олигонуклеотидного синт( за. Этот процесс часто называют рандомизованным синтезом (от англ. raivdora — беспорядочный). Нетрудно оценнть, что в 1 мкмоль смеси, содержащей 40-мерные рандомизованные последовательности, будет 4 ° = [c.306]

Также образование олигомерных соединений в замороженной среде было описано в работе [29], когда с помощью водорастворимого карбодиимида конденсация олигонуклеотидных блоков пен-та(2 -0-метилинозин-3 -фосфата) проводилась в присутствии комплиментарной матрицы полицитидина. Было найдено, что в случае реакции при -15 °С в замороженной системе степень полимеризации и выход продукта были выще, чем те же показатели синтеза в жидкой среде при О °С. Отсюда следовало, что проведение таких реакций в умеренно замороженных системах способствовало образованию цепных молекул. [c.75]

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы — субтилизина они применили метод химической мо дификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы химической модификации не только жестки и неспецифичны они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществляется при помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, сайт-специфический мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подх.одящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти — пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов. [c.183]

Олигонуклеотидные затравки неспецифичны, т. е. диаденило-вая кислота будет способствовать синтезу поли-А или поли-У, но полинуклеотидные затравки обладают некоторой специфичностью, т. е. поли-А может направлять свой собственный синтез, но не синтез поли-У или поли-(А, Г, У, Ц)-цепей. Молекулы поли-(А, Г, У, Ц) и поли-(А, У) могут быть использованы в каче- [c.255]

Обычный подход к синтезу олигорибонуклеотидов состоит в ступенчатом наращивании олигонуклеотидной цепи с 5 -конца. Для синтеза динуклеозидфосфатов используют обычно в качестве нуклеотидного компонента 2, 5 -защищенные рибонуклеозид-З -фос-фаты ЬХХХУ, а в качестве нуклеозидного компонента — 2, 3 -защи-щенные рибонуклеозиды ЬХХХУ . [c.94]

Еще одним доказательством комплементарной природы РНК, полученной на данной ДНК-затравке, служит образование специфического комплекса при нагревании с последующим охлаждением смеси ДНК-затравки и РНК-продукта. При эквимолекулярных соотношениях два полинуклеотида образуют гибридные комплексы, причем ренатурация ДНК исключается благодаря большей стабильности гибрида. Образование гибрида специфично для ДНК-затравки и не происходит с другими дезоксинуклеиновыми кислотами, даже если они обладают сходным нуклеотидным составом. Следовательно, средний нуклеотидный состав, анализ ближайшего соседа и полная комплементарность последовательности — все говорит о доминирующей роли последовательности нуклеотидов в затравочной ДНК в определении природы ферментативно синтезированной РНК- При использовании определенной бактериальной системы Mi ro o us lysodeikti us) не было обнаружено, чтобы матрица и продукт образовывали промежуточные соединения, гибриды (в отличие от ДНК-полимеразы). Далее, после ферментативного синтеза РНК не происходит изменений в плотности матрицы и денатурации (разделении нитей) ДНК- Следовательно, либо двухспиральная ДНК действует как матрица, не раскручиваясь, либо механизм заключается в том, что функционируют небольшие одноцепочечные олигонуклеотидные участки, непосредственно прилега- [c.319]

Для получения олигодезоксирибонуклеотидов используют также синтез на полимерной основе , разработанный в химии пептидов. Сущность его состоит в том, что нуклеозид связывают ковалентно с нерастворимым полимером и последовательно наращивают олигонуклеотидную цепь с З -конца. В заключение проводят расщепление ковалентной связи олигонуклеотида с полимером и последующее элюирование олигонуклеотида. Несомненным преимуществом данного метода является легкость очистки и выделения промежуточных и конечных соединений, что позволяет существенно увеличить выходы олигонуклеотидов. [c.395]

Выходы целевого олигонуклеотида при использовании стехпометри-ческих количеств обоих компонентов уменьшаются с увеличением длины олигонуклеотидного компонента. Высокие выходы могут быть получены путем применения избытка мононуклеотидного компоненаа, причем с увеличением размеров олигонуклеотидной цепи избыток мононуклеотида должен соответственно возрастать. При проведении ступенчатого синтеза полинуклеотидов необходимо учитывать, что растворимость промежуточных соединений уменьшается с увеличением длины цепи. В связи с этим усложняются требования, предъявляемые к защитным группам. Этим методом синтезированы разнообразные тринуклеотиды [c.400]

Разработано два варианта ступенчатого синтеза олигонуклеотидной цепи, в которых мононуклеотидными компонентами I служат 5 -0-ацетил-2 -0-тетрагидропиранилнуклеозид-3 -фосфаты или 5 -0-ацетил-2 -0-(а-этоксиэтил)-нуклеозид-З -фосфаты В качестве нуклеозидной [c.409]

Одна из наиболее часто возникающих проблем при анализе биологических текстов - поиск гомологий. И это понятно, поскольку схожесть текстов позволяет делать выводы об их эволюционной и/или функциональной близости. Здесь можно привести пример обнаруженной гомологии между определенными типами онкогенов и клеточными генами (НаЬагго et а1., 1984), что привело к возникновению нового направления исследований. Гомологии между последовательностями часто используют для реконструкции эволюционных деревьев. Такие важные аспекты анализа биологических текстов, как поиск повторов, палиндромов, симметричных участков, сайтов рестрикции, также связаны с проблемой поиска гомологий. Анализ гомологий необходим также при подготовке и проведении целого ряда экспериментальных работ, в частности при синтезе олигонуклеотидных зондов для поиска клонов в клонотеке, стыковке фрагментов нуклеотидных последовательностей при секвенировании протяженных участков ДНК или целых геномов и др. [c.11]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология