Гибридизация олигонуклеотидов

С разработкой быстрых и недорогих методов химического синтеза фрагментов ДНК методология молекулярно-биологических исследований ДНК существенно изменилась. Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать для конструирования целых генов или их фрагментов, для амплификации специфических фрагментов ДНК, для направленных мутаций изолированных ДНК, а также в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. [c.47]

Олигонуклеотиды, синтезированные химическими методами, находят широкое применение в молекулярной биотехнологии. Их используют в качестве зондов при ДНК-гибридизации, линкеров, соединяющих разные молекулы ДНК в экспериментах по клонированию, праймеров при секвенировании ДНК или осуществлении сайт-специфического мутагенеза клонированных генов-мишеней. [c.85]

Выявление аллелей (3-глобинового гена методом гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами [c.189]

Очень важным является использование синтетических олигонуклеотидов в качестве гибридизационных проб (зондов) для поиска нужных рекомбинантных колоний в генноинженерных экспериментах. Олигонуклеотид синтезируется в соответствии с данными, полученными из известной структуры белка илн ДНК, и после введения концевой метки используется для гибридизации [c.378]

Рис. 4.59, Олигонуклеотидный зонд (олигонуклеотид из 19 остатков) для гена нормального -глобина отличается от зонда для гена с мутацией, приводящей к -талассемии только заменой G -> А в интроне IVS-2. В соответствующих условиях гибридизации зонд для мутантного гена будет узнавать только мутантный ген, но не нормальный. Аналогичным образом нормальный зонд не будет гибридизоваться с мутантным геном.

Очень важной модификацией метода является гибридиза-ционный скрининг с радиоактивно меченным олигонуклеотидом, который применяется для мутагенеза. В данном случае этот олигонуклеотид служит зондом. Показано, что прочность гибридов сильно различается из-за того, что при гибридизации олигонуклеотид-зонд полностью комплементарен мутантной форме ДНК, а дикой форме ДНК одна пара оснований не комплементарна. На практике переносят отпечатки негативных колоний с чашки Петри на нитроцеллюлозный фильтр, проводят гибридизацию с олигонуклеотидным зондом при условиях, когда гибри-дизуются обе формы ДНК. Затем фильтр последовательно промывают при все более высокой температуре. Можно, таким образом, подобрать условия, при которых на радиоавтографе фильтра зоны почернения будут отвечать только мутантным формам ДНК. Этот метод особенно ценен тем, что позволяет изолировать мутации без их фенотипического проявления. [c.162]

ДНК — матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН. Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Примерно 90% из них содержат специфическую мутацию в клонированном гене. У остальных трансформантов клонированный ген не был изменен либо потому, что олигонуклеотид не гибридизо-вался с ним, либо потому, что он вытеснялся в ходе синтеза ДНК. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации. Все плазмиды, штаммы, ферменты, олигонуклеотиды (кроме того, который предназначен для изменения клонированного гена), а также буферы продаются в наборе, что облегчает работу. [c.163]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

Чтобы проверить это предположение, пришлось сначала провести эксперименты по клонированию и экспрессии гена эстеразы ювенильного гормона. Фермент выделили из насекомого Heliothis vires ens (совки) и очистили. Определили его аминокислотную последовательность, синтезировали олигонуклеотид, соответствующий одному из сегментов белковой молекулы, и использовали его в качестве зонда для гибридизации. Из библиотеки кДНК [c.343]

Зонд (Probe) 1. Соединение, меченное тем или иным способом и использующееся для выявления родственных биохимических молекул в сложном образце. 2. Олигонуклеотид, использующийся для выявления комплементарных последовательностей с помощью гибридизации. [c.549]

Для использования сэндвич-гибридизации в зонд нужно ввести спехщальные группы, обладающие высоким сродством к вспомогательному белку, несущему метку. Как и в иммуноферментном анализе, с этой целью часто используют биотин. Его легко присоединить к олигонуклеотидам или ввести в молекулу ДНК мягкой обработкой зонда. Например, небольшое число цитозиновых остатков можно превратить в производные, несущие алифатическую аминогруппу. С этой целью зонд обрабатывается этилендиамином или гексаметилен диамином в присутствии бисульфита натрия в соответствии с реакцией [c.262]

Для постановки ПЦР необходимо знать последовательность как минимум 17 пн с обеих сторон исследуемого фрагмента ДНК Обычно синтезируют два дезоксинуклеотида длиной 20-30 оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего нас фрагмента ДНК Используя комплементарные к этим участкам олигомеры — праймеры, запускают амплификацию Избыточные количества праймеров смешивают с геномной ДНК, а затем последовательно осуществляют реакции денатурации, отжига (реассоциации) и наращивания цепи (удлинение праймера) Тепловая денатурация сопровождается расплетением двойной спирали ДНК При снижении температуры имеет место отжиг олигонуклеотидов, то есть происходит гибридизация олигонуклеотидных праймеров со своими комплементарными последовательностями Наращивание цепи праймеров катализируется ДНК-полимеразой [c.204]

На чашку Петри с бактериальными колониями накладывают лист специального нейлонового фильтра на него переходит часть клеток бактерий каждой колонии, тогда как другая часть остается на чашке. В результате получается реплика на чашке и на фильтре колонии распределены одинаково. ДНК прочно связывается (иммобилизуется) с нейлоновым фильтром. Для лизиса бактерий и денатурации ДНК клонов нейлоновый фильтр обрабатывают щелочью. Затем фильтр помещают в раствор, содержащий меченый зонд (кДНК или мРНК, или синтетический олигонуклеотид). При гибридизации зонд связывается с теми колониями, которые содержат последовательности, комплементарные меченому зонду фильтр отмывают от несвязавшихся молекул зонда и проводят радиоав- [c.46]

Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) лиагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарущением какого-то одного гена. В больщинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в пени ДНК. кодирующей Р-пепь гемоглобина) В данном случае синтезируют два олигонуклеотида Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лищь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для больщинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами. [c.241]

Принцип методики ПЦР ясен из рис. 5-89, В. В каждом цикле реакции необходимо сначала кратковременное нагревание ДНК для разделения двух цепей двойной спирали (1-й этап) Последующее охлаждение ДНК в присутствии большого избытка двух упомянутых ДНК-олигонуклеотидов приводит к специфической гибридизации этих олигонуклеотидов с комплементарными последовательностями ДНК (2-й этап). После отжига смесь инкубируют с ДНК-полимеразой и четырьмя дезоксииуклеозидтрифосфатами, в результате чего избирательно синтезируются те участки ДНК, которые располагаются книзу от затравки (3-й этап). Для эффективной амплификации ДНК требуется от 20 до 30 циклов реакции В каждом последующем цикле количество ДНК по сравпепию с предыдущим циклом удваивается Отдельный цикл занимает около 5 мин, поэтому при автоматизации всей процедуры для бесклеточпого молекулярного клонирования какого-либо фрагмента ДНК требуется несколько часов, гогда как обычные процедуры клонирования растягиваются на несколько дней [c.341]

Для определения концентрации ДНК в растворе широко используются 3 метода. Наиболее простым и точным является спектрофотометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувствительностью. Однако, если содержание сумарной фракции ДНК невелико, концентрацию ее можно определить по интенсивности флуоресценции ее комплексов с бромистым этидием или бисбензимидом (Н33258), либо методом гибридизации со специфичным олигонуклеотидом. В таблице 6 представлены данные по чувствительности и специфичности спектрофотометрического и флуориметрическо-го методов анализа нуклеиновых кислот. [c.178]

Рисунок 21. Определения малых количеств человеческой ДНК методом гибридизации биотинилированного олигонуклеотида с образцами иммобилизованной ДНК. Визуализация образовавшегося ассоциаты происходит путем связывания с биотином конъюгата Пероксидазы хрена со Стрептавидином и дальнейшего окисления хромогена ТМВ.

Можно использовать ник-транслированный или меченный олигонуклеотидами зонд [22, 23]. В наших опытах, используя последнюю процедуру, мы получали значение удельной активности от 1 до ЗxlO имп./мин/мкг. Когда работают с гибридизационной смесью, содержащей декстрансульфат, необходимо добавлять не более 2—4 нг зонда в 1 мл. Для калибровки размеров при гибридизации в смесь можно включить SxlO имп./мин/мкг % [32р].днк. Показано, что ЯДНК не гибридизуется с человеческой геномной ДНК- [c.81]

Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК позволили исследователям разобраться в природе многих наследственных болезней человека. Эти методы дают возможность идентифицировать специфические мутации, приводящие к заболеванию [1—6], а также полиморфные участки ДНК, используемые в качестве маркеров в генетическом анализе [7—11]. Благодаря развитию методов выявления нуклеотидных замен стала реальностью пренатальная диагностика многих наследственных болезней человека. Если ген, отвечающий за заболевание, известен, соответствующую мутацию можно обнаружить в геномной ДНК или в РНК при помощи блот-гибридизации с использованием меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. В том случае, когда мутировавшая нуклеотидная последовательность неизвестна, замены нуклеотидов можно определить по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов <ПДРФ) [7]. ПДРФ обнаруживается по наличию или отсутствию сайта рестрикции во фрагменте геномной ДНК при гибридизации меченого ДНК-зонда с обработанной рестриктазами геномной ДНК, расфракционированной по размеру в агарозном геле и перенесенной на мембранный фильтр. Этот метод оказался очень эффективным для выявления как значимых мутаций, так и нейтрального полиморфизма в геноме человека и других организмов. Однако большую часть мутаций и полиморфных участков генома не удается обнаружить с помощью анализа ПДРФ, поскольку вероятность того, что замена нуклеотида изменит именно сайт рестрикции, низка. Так, например, многие точковые мутации гена р-глобина человека, вызывающие талассемию, не изменяют сайтов рестрикции, а потому не могут быть непосред- [c.123]

На этом этапе ДНК можно хранить в виде осадка под 1007о-иым этанолом и высушить под вакуумом иа более поздней стадии перед аиали-зом с помощью дот-блоттинг-гибридизации. Целостность векторной ДНК после эндоцитоза можно проверить и с помощью блоттинг-гибридизацин по Саузерну (гл. 5), чтобы убедиться в целостности вектора. Считается, что поглощение в присутствии ПЭГ происходит очень быстро, поэтому в среду для инкубации крайне редко включают ингибиторы иуклеаз. Основные принципы введения метки в ДНК с помощью олигонуклеотид-иой затравки и проблемы, связанные с гибридизацией ДНК, обсуждаются в разд. 5.5 и 5.6. [c.212]

Наносят определенный объем (до 10 мкл) образца в центр стеклянного фильтра GF/ (Whatman) диаметром 2,4 см. При использовании олигонуклеотидов (разд. 5.6) 15 мкл реакционной смеси доводят до 100 мкл, добавляя 85 мкл стоп-раствора (или раствора для гибридизации), и 1 мкл наносят на фильтр. [c.302]

Если можно получить пробы для гибридизации (синтетические олигонуклеотиды или кДНК, или геномные субклоны), комплементарные негомологичным областям нуклеотидной последовательности в нетранслируемой области транскрипта и помогающие различить нативный и перенесенный ген в трансгенных растениях или же различить транскрипты, образовавшиеся в результате экспрессии различных членов мультигенного семейства (например, экспрессия семейства генов ab в петунии [12]). [c.325]

Все чаще для идентификации бактерий предлагают дендрограммы, показывающие взаимоотношения между бактериальными родами, видами или штаммами на основании изучения последовательности нуклеотидов (или олигонуклеотидов) в рРНК, а также ДНК—ДНК и ДНК—рРНК гибридизации. Однако различия в темпе эволюции у разных групп организмов, а также трудоемкость и дороговизна этих методов, не дают возможность использовать только филогенетический подход для систематики бактерий. Более того, идентификация бактерий до родов на основании только генетических методов без предварительного изучения их фенотипических характеристик часто вообще невозможна. Поэтому лучшим подходом в работе по систематике бактерий является изучение как генотипических, так и фенотипических свойств. В случае несоответствия между филогенетическими и фенотипическими данными приоритет временно отдают последним. [c.198]

Смотреть страницы где упоминается термин Гибридизация олигонуклеотидов: [c.405] [c.48] [c.29] [c.90] [c.160] [c.189] [c.196] [c.506] [c.506] [c.553] [c.260] [c.380] [c.333] [c.337] [c.76] [c.188] [c.197] [c.43] [c.43] [c.55] [c.55] [c.165] [c.218] [c.229]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология