Гомохроматография

Отщепление Т резко уменьшает подвижность при электрофор>езе и мало увеличивает при гомохроматографии. [c.319]

Отщепление А незначительно увеличивает подвижность при электрофорезе и сильно — при гомохроматографии. [c.319]

Отщепление С сильно увеличивает подвижность при электрофорезе и незначительно — при гомохроматографии. [c.319]

С этим связано другое название цля гомохроматографии — вытеснительная хроматография. — Прим. ред. [c.94]

Двумерное фракционирование олигонуклеотидов в первом направлении — электрофорезом в кислом пиридин-ацетатиом буфере на полоске ацетилцеллюлозы, во втором — гомохроматографией или элюцией солевым градиентом на пластинке ДЭАЭ-целлюлозы. [c.460]

С тех пор метод эволюционировал особенно плодотворным оказалось введение теми же авторами для разделения во втором направлении хроматографии на пластинках ДЭАЭ-целлюлозы с элюцией так называемой гомосмесью ( гомохроматография ). Такой вариант двумерного фракционирования олигонуклеотидов подробно описан в статье Баррелла, основные положения которой (для сопоставления с последующими модификациями) пмеет смысл теперь рассмотреть [Barrell, 1971]. [c.496]

Волькерт и соавторы в ходе расшифровки первичной структуры РНК фага MS2 использовали тот же метод с небольшими модификациями. Так, для гомохроматографии они пользовались продажными [c.498]

Такую смесь меченых фрагментов олигонуклеотида снова подвергают двумерному фракционированию электрофорезом на ацетилцеллюлозе и гомохроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, как описано выше, а затем проводят авторадиографию. Однако теперь вместо разбросанных по всей иластпнке иятен фингерприита получается зигзагообразная цепочка следующих друг за другом пятен (рис. 173), анализ расположения которых дает информацию о последовательности нуклеотпдов в олигонуклеотиде. [c.504]

Поясним, на чем базируется этот анализ. Начнем со второго направления фракционирования — гомохроматографии. Из того, что было сказано раньше, следует, что удаление фрагментов от старта во втором направлении будет тем больше,чем короче фрагмент. Поскольку мы знаем, что на авторадиограмме представлены фрагменты любой длины, отличающиеся друг от друга на один нуклеотид, мы можем заключить, что в верхнем иятне находится концевой [5 - Р]моно-нуклеотид, и т. д. Поскольку на рис. 173 имеется 13 пятен, нижнее пятно соответствует исходному [5 - Р тридекануклеотиду. Пурины, как известно, дают более заметный вклад сорбции на целлюлозной матрице, чем ппримидины, поэтому укорочение иа пиримидиновое звено приводит к меньшему сдвигу пятна укороченного фрагмента вверх, чем потеря З -концевого пурина. [c.504]

Эта особенность привела к очень хорошему преимуществу в гомохроматографии. Это метод, в котором радиоактивные олнго-нуклеотндные фрагменты обнаруживают на хроматограмме с помощью раствора, содержащего нерадиоактивную смесь фрагментов всех размеров, получаемую РНазным расщеплением неочищенной РНК. На пластинках для ТСХ с ДЕАЕ- или полиэтиленимин-целлюлозой меньшие по размеру полианионы располагаются вдоль больших, когда фаза катионной подложки насыщена фрагментами нуклеотидов. Таким образом, радиоактивный образец разделяется на серию фронтальных полос, которые четко детектируются авторадиографией 131]. [c.194]

В методе блуждающего пятна эти две задачи рещаются одновременно. Смесь меченык фрагментов подвергается двумерному разделению. Сначала оно проводится путем электрофореза на полосках ацетата целлюлозы при pH 3,5 (разделение по составу), а затем влажная полоска прикладывается к краю пластинки с ДЭАЭ целлюлозой. которая сорбирует частично ра деленные олигонуклеотиды, и разделение ведется в направлении, перпендикулярном первому (разделение по длине). В качестве элюента используется гидролизат РНК. содержащий олигонуклеотиды всех возможных длин и составов (такая процедура называется гомохроматографией). [c.318]

При гомохроматографии разчеление происходит в соответствии со следующими закономерностями чем больше д.1ина олигонуклеотида, тем он менее подвижен, так что каждые два соседних пятна представляют собой олигонуклеотиды, отличающиеся на одно звено если два соседних пятна получены в результате отщепления пуринового нуклеотида, то расстояние между ними по вертикали больше, чем при отщеплении пиримидинового нуклеотида. [c.319]

В качестве примера рассмотрим анализ радиоавтограммы, приведенной на рисунке ПЧ. Очевидно, что наименее подвижный при гомохроматографии компонент представляет собой исходный олигонуклеотид. Соседний с ним продукт образуется путем отщепления З -концевого звена при электрофор>езе подвижность его слегка увеличивается, а при гомохроматографии — резко возрастает. Отсюда делается вывод, что отщепленным звеном является А. Следующий продукт (3) отличается от продукта (2) также одним звеном. Он значительно менее подвижен при электрофорезе и несколько более подвижен при гомохроматографии, следовательно, (3) образуется из (2) в результате отщепления Т. Продолжая такой анализ, определяют звено, которым отличается друг от друга каждая пара соседних пятен, т. е. кониевые звенья каждого олигонуклеотида смеси. Читая эти концевые нуклеотиды, можно восстановить исходную последовательность. [c.319]

Рис. 8.4. Гомохроматография -РНК-азного гидролизата РНК фага R17 (Adams et al.,, 1969). Стрелкой обозначен фрагмент А, который содержит кодоны, соответствующие части белка оболочки.

Другую широко используемую хроматографическую систему, подобную системе б, получают растворением 50 г дрожжевой РНК в 500 мл воды. РНК добавляют к воде постепенно при непрерывном перемешивании, причем pH поддерживают в интервале 7-8 добавлением 10, н. КОН. Когда растворение закончится, pH доводят до 7 и раствор диализуют против воды в непрерывном противоточном диализаторе (фирмы " Omnive tor Instruments " ). Продолжительность диализа 2 ч на каждые 200 мл раствора. Пос-ле дизлиза растворы РНК, общий объем которых уменьшается до 500 мл, объединяют, добавляют 420 г мочевины и разбавляют водой до 1 л. Этим методом можно приготовить большие количества системы для гомохроматографии с хорошо воспроизводящимися характеристиками. [c.277]

Гомохроматографию проводят при 60 С. Для этого как пластинку, так и хроматографическую камеру с растворителем предварительно выдерживают при этой температуре около 30 мин. Затем пластинку помещают в камеру, последнюю закрывают и проводят восходящую хроматографию. Когда фронт достигает верха пластинки (в случае пластинки с толщиной слоя 0,1 мм для этого необходимо 2-4 ч, со слоем 2 50 мкм - до 9 ч ), ее вьгаимаютэ тщательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой, как и при использовании DEAE-бумаги. [c.278]

Проблемы, связанные с разделением длинных олигорибонуклеотидов, были решены Браунли и Сейгером [126], которые ввели в практику исследований метод, известный под названием гомохроматография . Суть этого метода заключается в том, что после фракционирования олигорибонуклеотидов с помощью ионофореза на ацетате целлюлозы Р-меченные олигомеры переносят на лист бумаги из DEAE-целлюлозы и хроматографи- [c.189]

Для фракционирования олигорибонуклеотидов может быть также использован двумерный гель-электрофорез [127]. В ходе первой стадии электрофореза, которую проводят в 0,025 М лимонной кислоте, содержащей 6 М мочевину, происходит разделение олигомеров в соответствии с их размерами и нуклеотидным составом, а вторая стадия представляет собой обычный электрофорез при pH 8 [127].С помощью этого метода можно разделить олигомеры длиной до 80 нуклеотидных остатков. Путем сравнения картин распределения пятен ( отпечатков пальцев ), отвечающих разделенным с помощью двумерного электрофореза [и (или) гомохроматографии] олигорибонуклеотидам двух РНК, нуклеотидная последовательность одной из которых известна, можно оценить степень структурной гомологии этих РНК, а затем отобрать для дальнейшего анализа лишь такие олигорибонуклеотиды второй РНК, которые по подвижности не совпада-чют ни с одним из фрагментов РНК с известной структурой (рис. 10.11). [c.190]

Разделив продукты исчерпывающего или частичного гидролиза РНК с помощью рибонуклеазы, структуру большинства РНК устанавливают путем сравнения нуклеотидных последовательностей перекрывающихся фрагментов. Каждый индивидуальный олнгорибонуклеотид подвергают частичному гидролизу с помощью менее специфичной рибонуклеазы (например, с помощью рибонуклеазы Тг), которая расщепляет все фосфоди-эфирные связи. Реакцию проводят в таких условиях, чтобы получить набор фрагментов, различающихся по длине на один нуклеотидный остаток. С помощью двумерной гомохроматографии на пластинках с DEAE-целлюлозой разделяют эти продукты и по характеристическому изменению подвижности укороченных на одно звено фрагментов судят о природе нуклеотидного остатка, который в исходном олигорибонуклеотиде занимал соответствующее положение. Таким образом можно прочитать всю хроматограмму и установить полную нуклеотидную последовательность данного олигорибонуклеотида [5, 128]. [c.190]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология