Ступенчатые градиенты sl для ротора

Первые две процедуры позволяют избавиться от фрагментов тканей, обрывков клеток и крупных ядерных органелл (ядер, митохондрий). Супернатант после второго центрифугирования фильтруют и центрифугируют 60 мин при 145 000 Полученый осадок ресуспендируют в среде гомогенизации и центрифугируют 120 мин при 95 000 g в ступенчатом (25 %, 30, 40 %) градиенте плотности сахарозы, содержащем 5 мМ имидазола-НС1 (рН=7,2). Образовавшиеся белковые зоны, локализованные в верхних слоях растворов сахарозы, отбирают и разводят в 20—25 раз средой гомогенизирования и центрифугируют с целью концентрирования при 145 ООО g в течение 60 мин (ротор РПУ-35). Супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в среде хранения, содержащей 25 % (по объему) глицерина, [c.220]

Приготовление ступенчатого градиента фиколла. Тщательно промойте необходимое количество центрифужных пробирок для ротора 8Ш41 абсолютным спиртом, высушите в перевернутом положении в ламинарном боксе. Приготовьте градиент фиколла, используя уравновешенные исходные растворы (рис. 2). [c.18]

Ресуспендируют ядра в 7 мл буфера для выделения и наслаивают на ступенчатый градиент плотности перкола, приготовленный из 7 мл 35%-иого перкола и 7 мл 80%-ного перкола, растворенного в буфере А для выделения ядер в стерильных силиконированных пробирках из корекса. Центрифугируют в бакет-роторе при 8000 g в течение 30 мин при 4 °С. Между двумя слоями будут располагаться ядра, свободные от клеточного дебриса, что контролируют с помощью окрашивания акридиновым оранжевым (приложение 2 [VII], В). Эту зону отбирают и разводят 25 мл буфера для выделения ядер. Ядра осаждают и еще раз промывают тем же буфером (1000 г, бакет-ротор). [c.257]

I мл суспензии - 0,5 г СаС1). После растворения хлористого цезия нанесите фаговую суспензию на ступенчатый градиент СвС1 приготовленный на ЗМ буфере в нитроцел-лвлозных пробирках для ротора sw-28. Градиент состоит из трех ступеней, с плотностью 1,7 1,5 и 1,45 г/мл. Центрифугируйте 2 часа, 22 ООО об/мин при 4°С. а,говые частицы будут расположены на границе меаду слоями с плотностями 1,45 и 1,5 г/мл. [c.2]

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна (например, для постановки RIA или ELISA), его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом — плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются примером может служить использование градиентов глицерина — тартрата калия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки. [c.100]

Такое послойное смещение будет реально иметь место в том случае, если преформировать ступенчатый градиент плотности в пробирке углового ротора. Начнем, очевидно, с наслаивания растворов разной плотности в вертикально стоящей пробирке (рис. 67, а). Затем установим ее наклонно в ротор (рис. 67, б). Границы раздела слоев разной плотности, очевидно, останутся горизонтальными. По мере ускорения вращения ротора и нарастания центробежной силы более плотные слои жидкости будут стремиться занять наиболее удаленную от оси вращения часть объема пробирки, вытесняя оттуда менее плотную жидкость. Аналогичным образом поведут себя и остальные слои, в каждом случае уступая удаленную часть объема пробирки более плотному слою жидкости, в результате при достаточно большой скорости вращения ротора (когда центробежные силы во много раз превысят силу тяжести) все слои расположатся в том же порядке, что и вначале,, но границы между ними будут проходить вертикально (рис. 67, в). Произойдет переориентация слоев. [c.254]

Для последующей очистки митохондрий осадок суспендируют в 2 мл среды выделения и. наносят на ступенчатый градиент плотности сахарозы, состоящий из следующих слоев 7 мл 1,1 М сахарозы, 15 мл 0,8 М сахарозы, 15 мл 0,5 М сахарозы и 10 мл 0,3 М сахарозы. Эти растворы готовят на 0,15 М калийфосфатном буфере при pH = 7,0, содержащем 5 мМ ЭДТА и 1 % альбумина. Градиент готовится предварительно и выдерживается на холоде в течение 2—3 ч. Центрифугирование материала в ступенчатом градиенте проводится в бакетном роторе при 7500 об/мин в течение 45 мин. [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология