Изопикнический градиент центрифугирования

Во втором варианте проводят равновесное, или изопикническое, центрифугирование, при этом используют градиент, охватывающий весь диапазон плотности разделяемых частиц. На дно помещают раствор с плотностью, превышающей плотность самого тяжелого компонента смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока все частицы не разделятся по зонам, соответствующим их собственной плотности. [c.66]

Таблица 1.3. Изопикническое центрифугирование в градиентах плотности

Изопикническое центрифугирование и центрифугирование в комбинированных зонально-плотностных градиентах [c.101]

Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем. Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярный вес которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают, и образец суспендируют в среде, плотность которой такая же, как и у [c.48]

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна (например, для постановки RIA или ELISA), его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом — плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются примером может служить использование градиентов глицерина — тартрата калия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки. [c.100]

Получение вирусов из фракций градиентов. На последней стадии очистки необходимо удалить вещество, образующее градиент. На промежуточных стадиях обычно достаточно развести содержащие вирус фракции равным объемом буферного раствора, чтобы материал можно было непосредственно наносить на следующий изопикнический градиент. Поскольку для зонального центрифугирования объем образца должен быть небольшим, разведение фракций предыдущего градиента в этом случае, как правило, невозможно поэтому предпочтительно проводить зональное центрифугирование перед изопикническим, если используемая схема очистки включает оба варианта центрифугирования. Полного удаления вещества, образующего градиент, достигают диализом, гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-50 или разведением с последующим ультрацентрифугированием. Диализ очищенного материала проводят в нескольких сменах подходящего буферного раствора (например, GTNE, хотя в некоторых случаях для последующего использования очищенного вируса может потребоваться другой буфер). Колонку с сефадексом уравновешивают, пропуская через нее пятикратный по отношению к образцу объем того буферного раствора, в котором должен быть растворен очищенный вирус. Появление вируса в свободном объеме колонки при элюции регистрируют по поглощению в ультрафиолете или [c.103]

Перед начален центрифугирования суспензию частиц наслаивают поверх градиента плотности жидкости (а). При скоростноы цеитрифугироваини частицы не достигают изопикни-ческой точки, а при изопикническом разделении центрифугирование продолжают до тех пор, пока исследуеыые частицы не достигнут зоны с соответствующей плотностью (б). [c.47]

Обычно миелин получают гемогенизацией нервной ткани с последующим фракционированием посредством центрифугирования в градиенте плотности. Его плотность составляет 1,08 г/мл, что позволяет применять изопикнические методы. Данные анализа, полученные различными исследователями, отличаются причиной могут быть примеси аксональной мембраны. [c.99]

Для изопикнического центрифугирования большинства тогавирусов подходят 20—50%-ные (вес на вес) непрерывные линейные градиенты концентрации сахарозы. В комбинированных градиентах глицерина — тартрата калия [14] верхнюю (менее плотную) часть образует 30%-ный (вес на вес) раствор глицерина в 50 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА (pH 7,5), а нижнюю (более плотную)—50%-ный (вес на вес) раствор тартрата калия. pH раствора тартрата калия не должен быть ниже 8,5, так как при более кислых значениях образуется осадок. Из этих растворов обычными способами готовят линейные градиенты. Поскольку в таких градиентах вирус концентрируется в зоне с со- [c.101]

Данный метод требует более длительного центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (16 ч при 73 000 g) или метризамида (15—45%-ный градиент, 190000 g, 6 ч). Растворы метризамида обладают более низкой вязкостью и осмотическим давлением, чем растворы сахарозы, и поэтому их использование для изопикнического центрифугирования предпочтительно. Растворы метризамида всегда следует готовить непосредственно перед использованием на 10 мМ HEPES, pH 7,8 [26]. [c.151]

Дальнейщую очистку вируса проводят повторным центрифугированием в градиенте. Применяют либо зональное центрифугирование в 15—60%-НОМ градиенте концентрации сахарозы, либо, предпочтительно, изопикническое центрифугирование в 20—45%-НОМ (вес на объем) градиенте плотности тартрата калия. [c.186]

Предложено два альтернативных метода очистки вируса. Стандартный метод Смита и др. [5] включает стадии зонального центрифугирования вируса в градиенте концентрации сахарозы я последующего изопикнического центрифугирования в градиенте плотности s l. [c.206]

Другой способ заключается в наслаивании образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с плотностью соответствующих зон, т. е. пока не произойдет разделение частиц по зонам. Метод получил название зснально-изопикнического, или рв -зонального центрифугирования, так как основным моментом здесь является плавучая плотность (рв), а не размеры или форма частиц (рис. 2.4). На величину плотности, при которой частицы образуют изопикнические полосы, влияет природа среды суспендирования частицы могут быть проницаемыми для одних соединений, находящихся в растворе, и непроницаемыми для других или же присоединять молекулы раствора. При использовании зонального ротора (разд. 2.5.3) митохондрии, лизосомы, перок-сисомы и микросомы концентрируются в полосах с 42 %-, 47%-, 47%-и 27%-НОЙ сахарозой, соответствующих плотности 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 г-см"3 соответственно. Плотность субклеточных органелл зависит также и от избирательного поглощения ими определен- [c.48]

Еще один метод разделения органелл основан на равновесном (изопикническом) центрифугировании в градиенте плотности. Полученный из листьев экстракт наслаивают иа градиент концентрации сахарозы и затем центрифугируют до тех пор, пока органеллы не достигнут равновесного положения в градиенте в соответствии с нх плавучей плотностью. Разделение оргаиелл в данном случае основано ие на различии в скорости нх седиментации, а на различии в их плотности. Пероксисомы имеют более высокую плавучую плотность, чем интактные хлоро-лласты, а интактные хлоропласты имеют более высокую плавучую плотность, чем интактные митохондрии. Обычно полученные из листьев экстракты наслаивают на градиент концентрации сахарозы (примерно 20—60% по весу), который затем центрифугируют в роторе с подвесными стаканами в течение 3—4 ч при 100 000 g. Равновесное положение пероксисом достигается при Ллотности 1,25, интактных хлоропластов — при плотности 1,20—1,22, а митохондрий — при плотности 1,18—1,20. Бо- лее высокая плавучая плотность пероксисом может быть юбусловлена тем, что они частично проницаемы для сахарозы. После центрифугирования градиент делят иа фракции (объемом около 1 мл весь объем стакана обычно составляет [c.416]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология