Зонально-скоростное центрифугирование

Существуют два варианта этого метода. В первом проводят зонально-скоростное центрифугирование, при этом используют градиент с небольшим диапазоном концентраций. Его функция состоит главным образом в предотвращении перемешивания фракций при центрифугировании вследствие конвекции. Нанесенный на градиентный раствор гомогенат или грубую фракцию мембран центрифугируют непродолжительное время. Частицы распределяются в соответствии со скоростями их седиментации. При достаточно большом времени центрифугирования все фракции поочередно осаждаются на дно пробирки. [c.66]

Зональное (скоростное] центрифугирование [c.16]

Высокоскоростные роторы с пробирками объемом 4 4 и 5 мл (SW 50.1, SW 55 Ti, SW 60 Ti и SW 65 Ti). Они удобны для равновесного и зонально-скоростного центрифугирования, где не требуется особенно хорошее разрешение. [c.191]

Подробнее геометрия бакет-роторов будет рассмотрена в. главе 5, посвященной зонально-скоростному центрифугированию. [c.191]

На схеме 5 показан конечный момент зонально-скоростного центрифугирования. Ротор закрыт пробкой и вращается с большой скоростью. Частицы распределились вдоль градиента в соответствии с их константами седиментации. [c.195]

Глава 5 ЗОНАЛЬНО-СКОРОСТНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ [c.201]

Исходную смесь частиц разных размеров наносят. в виде тонкого слоя на более плотную среду, заполняющую весь объем пробирки бакет-ротора или полости зонального ротора (для зонально-скоростного центрифугирования используют только эти два типа роторов). В ходе центрифугирования наиболее тяжелые частицы быстро продвигаются ко дну пробирки или к пе- [c.201]

Зонально-скоростное центрифугирование используют т только для разделения (фракционирования) частиц, но и для определения их характеристик — размеров и плотности. С этой целью удобно ввести величину, зависящую только от этих двух параметров частицы и поддающуюся количественному определению методом ультрацентрифугирования. В интересах сопоставления различных экспериментальных данных эта величина должна иметь универсальный характер, т. е. не зависеть от условий ее определения. Такой величиной служит константа седиментации частицы. [c.203]

Это соотношение подсказывает простой способ определения константы седиментации исследуемых молекул путем сопоставления их с маркером — веществом такой же природы (белок, ДНК или РНК), но с известным значением Sjo.w. Оба эти вещества надо, предварительно смешав, разделить зонально-скоростным центрифугированием в изокинетическом градиенте плотности, а затем по соотношению расстояний, пройденных их зонами от мениска, рассчитать искомую величину S2o,w = S2o, m(///m). Буквой м обозначен маркерный препарат. Для цилиндрической части пробирки отношение расстояний от мениска можно заменить отношением соответствующих им объемов. Опорожнять пробирку в этом случае удобнее, начиная с мениска (см. ниже). Объемы нередко заменяют числом капель. При этом следует проявлять осторожность, так как объем падающей в коллектор капли зависит от поверхностного натяжения и плотности жидкости, а они неодинаковы на разных участках градиента плотности. [c.205]

Практически удается разделить и охарактеризовать с пог мощью зонально-скоростного центрифугирования частицы, отличающиеся между собой по значению го, не менее чем на 10%. [c.206]

Метризамид имеет определенные преимущества перед сахарозой в отношении плотности и вязкости его растворов. При одинаковой концентрации вязкость раствора метризамида несколько меньше, чем раствора сахарозы, а плотность — существенно выше. Это означает, что для создания устойчивых градиентов плотности растворов метризамида требуются заметно меньшие его концентрации. И все же метризамид практически почти не используют для зонально-скоростного центрифугирования, что объясняется рядом причин. Одна из них, как будет видно ниже,— очень низкие значения плавучих плотностей нуклеиновых кислот в его растворах и, следовательно, малые скорости осаждения [c.209]

Таким образом, почти единственным (во всяком случае, преимущественно употребляемым) материалом для создания градиентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании является сахароза. Остановимся подробнее на свойствах ее растворов, способах образования градиентов плотности, выборе режимов центрифугирования и приведем несколько примеров центрифугирования в градиентах сахарозы. [c.210]

С помощью предложенных выше подходов проанализируем несколько описанных в литературе примеров использования зонально-скоростного центрифугирования в градиентах сахарозы с точки зрения выбора режима. Одновременно составим представление о порядках значений скорости и продолжительности центрифугирования в наиболее типичных случаях фракционирования белков и нуклеиновых кислот. Примем следующие приблизительные значения плавучей плотности (р, г/см ) для белков 1,3 для ДНИ 1,35 для ДНК и РНП 1,4 для РНК 1,5. [c.232]

Здесь уместно отметить достаточно большую свободу выбора условий зонально-скоростного центрифугирования и возможность их широкого варьирования в разумных пределах. Важно лишь обоснованно оценить эти пределы — порядок значений скорости и продолжительности центрифугирования, а главное — выбрать наиболее удобную форму градиента сахарозы. К тому [c.233]

В заключение еще раз отметим, что выбор режима зонально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности растворов сахарозы достаточно свободен. Изменение продолжительности центрифугирования на 20%, как правило, не очень сильно меняет характер фракционирования. Важно лишь правильно оценить соотношение значений г ., , разделяемых компонентов в препарате, диктующее выбор крутизны градиента сахарозы. Затем для максимально допустимой скорости имеющегося в распоряжении бакет-ротора (с длинными пробирками) с помощью номограмм следует найти ориентировочную продолжительность центрифугирования. Ее можно затем уточнить после первого пробного опыта. [c.239]

Однако ротор с вертикальными пробирками можно успешно использовать и для зонально-скоростного центрифугирования вместо бакет-ротора. В отличие от углового ротора относительно тяжелые частицы не будут здесь попадать на стенку пробирки вплоть до момента прохождения ими всего градиента плотности. Приведенные выше рассуждения о том, что стенка пробирки углового ротора не влияет на образование градиента плотности солевого раствора, не относятся к поведению фракционируемых частиц при зонально-скоростном центрифугировании, ведь плотность этих частиц заведомо больше, чем максимальная плотность раствора сахарозы. Попав в любой части пробирки на ее стенку, частицы, а тем более их агрегаты, будут легко соскальзывать по стенке на дно пробирки. Всего этого не будет в вертикально стоящей пробирке. [c.257]

Таким образом, на практике в настоящее время бакет-рото ры используют для зонально-скоростного центрифугирования, угловые —для равновесного, а роторы с вертикальными пробирками — как для того, так и для другого. Для сбора осадков при дифференциальном центрифугировании одинаково пригодны как угловые, так и бакет-роторы, а роторы с вертикальными пробирками неудобны осадок образуется не на дне. а вдоль образующей цилиндрической части пробирки. [c.258]

В 1957 г. Майер и др. [195], используя зональное скоростное центрифугирование, разделили частично очищенные препараты полиовируса на четыре зоны, обозначив их буквами А, В, С и О. Первые две были связаны с посторонними примесями. Наиболее быстро седиментирующая зона. О, содержала инфекционные вирионные частицы, а зона С — частицы вирионного размера, которые впоследствии были идентифицированы как [c.235]

Роторы для умеренных скоростей вращения, но с относительно длинными пробирками объемом от 13,2 до 17 мл. Они особенно удобны для разделения близких по массе частиц методом зонально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. К этой группе относятся роторы SW 28.1 (SW 27.1), SW 40Ti и SW 41 Ti. [c.191]

Для создания градиентов плотности среды при зонально-скоростном центрифугировании нашли применение растворы следующих веществ сахарозы, глицерина, метризамида ( Ме1п8ат1-с1е ), фиколла ( р1соП ) и перколла ( РегсоИ ). Первые два вещества общеизвестны, поэтому приведем краткие характеристики трех остальных. [c.206]

Фиколл и перколл явно непригодны для зонально-скоростного центрифугирования белков и нуклеиновых кислот. При тех ко 1центрациях, которые необходимы для обеспечения устойчивости градиента плотности, вязкость их растворов слишком высока. [c.209]

При препаративном фракционировании ДНК зонально-скоростным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы можно для подбора режима воспользоваться предварительной окраской ДНК бромистым этидием. Центрифугирование затем можно прервать и наблюдать положение зон ДНК в пробирке, освещая ее ультрафиолетовым светом (336 нм). После отделения зон бромистый этидий экстрагируют бутанолом [Raafat-El-Ge-wely, Helling, 1980]. [c.222]

В начале главы были указаны причины относительно редкого использования глицерина для создания градиентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании. Главным его недостатком является более высокая вязкость растворов по сравнению с растворами сахарозы той же плотности. Однако недавно повышенная вязкость концентрированных растворов глицерина была использована для фракционирования относительно тяжелых оЛигонуклеосом. Хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фракционировали в градиенте 7,6— 76% (по объему) глицерина при 130 ООО g в течение 16 ч. Профиль олигонуклеосом от моно- до пентамеров равномерно распределялся по этому градиенту [Rennie, 1979]. [c.239]

Из очищенных ядер РНП-частицы экстрагировали при 37 0,01 М Трис-H l (pH 8) с 0,1 М Na l и 1 мМ АТФ (АТФ способствует выходу частиц из ядра). Их собирали центрифугированием при 60 000 об/мик в течение 4 ч и предварительно очищали зонально-скоростным центрифугированием в градиенте сахарозы, собирая фракцию с константой седиментации около 40S. Эту фракцию переносили в полиалломерные пробирки ротора SW 41, фиксировали добавлением глутарового альдегида до 6% в течение 1 ч при 0°, а затем смешивали с концентрированным водным раствором s l с таким расчетом, чтобы исходная плотность при центрифугировании составляла 1,5 г/ м а объем смеси —5 мл. Остальной объем пробирки (8 мл) заполняли парафиновым маслом. Центрифугирование вели при 30 000 об/мии и 25 в течение 60 ч. Собирали 30 фракций. 40 S РНП-частицы выходили острым пиком в области р= 1,4 г/см . Аналогичным образом исследовали плавучую плотность рибосом, а по ней определяли содержание в них белка. Рибосомы фиксировали обработкой 6%-ным раствором формальдегида. [c.262]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология