Градиент плотности ступенчатый

Растворы для формирования ступенчатого градиента плотности сахарозы (состав растворов см. 3.1). [c.155]

Интактные хлоропласты можно выделить из листьев табака путем простой гомогенизации и очистки в ступенчатом градиенте плотности фиколла (см. также разд. 4.5). После обработки протеиназой для удаления примесей белков цитоплазмы, включая вновь синтезированную NPT-П, хлоропласты лизируют и изучают ассоциированную с ними ферментативную активность. [c.343]

Затем через второй патрубок медленно (4 мл/мин) по стенке подают в колонку рабочий раствор, формируя при этом ступенчатый или плавный градиент плотности. При создании ступенчатого градиента в 33 нумерованные пробирки помещают по О, 0,1, 0,2... 3,2 мл разбавленного раствора сахарозы с амфолитами и по 3,2, 3,1, 3,0, 2,9... О мл концентрированного раствора сахарозы. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и поочередно, вручную или с помощью перистальтического насоса, вносят в рабочую камеру. [c.307]

Разделение липопротеидов плазмы с помощью ультрацентрифугирования основано на существенном различии в плотности липидов и белков (соответственно 0,88—1,06 и 1,30—1,35). Различные классы липопротеидов плазмы, имеющие разное соотношение липид белок, характеризуются определенными значениями плотностей. Один из вариантов этого метода включает измерение скорости флотации (в единицах Сведберга, 5г) липопротеидов в водной среде данной однородной плотности. Величина 5 зависит от плотности, размера и формы молекулы липопротеида. Липопротеиды наиболее низкой плотности (низкое отношение белок липид) имеют наибольшее значение Другой вариант основан на центрифугировании по градиенту плотности. С этой целью плотность плазмы ступенчато повышают добавлением растворов веществ, не влияющих на ее свойства, в результате чего липопротеиды в процессе ультрацентрифугирования концентрируются в виде полос в тех местах раствора, где его плотность соответствует плотности липопротеида. [c.369]

Чтобы стабилизировать слой клеток, непосредственно под ним создают закругленный профиль градиента, подавая из промежуточного резервуара (Г) 50 мл 0,35%-ного раствора фиколла в результате образуется сглаженный ступенчатый градиент плотности (рис. 2). [c.258]

Разумеется, эти данные ориентировочны и могут несколько изменяться от объекта к объекту. Однако из сопоставления их с табличными следует возможность зонально-скоростного фракционирования белков и нуклеиновых кислот при умеренных концентрациях растворов сахарозы (до 40%) и затруднительность такого фракционирования для мембран и содержащих мембраны органелл. Вместе с тем возможно их разделение в ступенчатых градиентах плотности сахарозы — на интерфазах. [c.211]

Для последующего разделения суспензии хлоропластов на фракции, отличающиеся по размерам органоидов и их целостности, проводят разделение материала в ступенчатом или линейном градиенте плотности сахарозы, фиколла или хлорида цезия. При этом органоиды распределяются после центрифугирования в градиенте плотности в соответ ствии со своей плотностью. [c.167]

Дальнейшая очистка препаратов хлоропластов от компонентов клетки осуществляется путем центрифугирования их в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. [c.169]

Для получения градиента плотности сахарозы в центрифужные пробирки (с прозрачными стенками) объемом около 40 мл с помощью пипетки осторожно по стенке наслаивают столбик ступенчатого градиента сахарозы, приготовленной на основе среды выделения. Структура градиента следующая [c.169]

Первые две процедуры позволяют избавиться от фрагментов тканей, обрывков клеток и крупных ядерных органелл (ядер, митохондрий). Супернатант после второго центрифугирования фильтруют и центрифугируют 60 мин при 145 000 Полученый осадок ресуспендируют в среде гомогенизации и центрифугируют 120 мин при 95 000 g в ступенчатом (25 %, 30, 40 %) градиенте плотности сахарозы, содержащем 5 мМ имидазола-НС1 (рН=7,2). Образовавшиеся белковые зоны, локализованные в верхних слоях растворов сахарозы, отбирают и разводят в 20—25 раз средой гомогенизирования и центрифугируют с целью концентрирования при 145 ООО g в течение 60 мин (ротор РПУ-35). Супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в среде хранения, содержащей 25 % (по объему) глицерина, [c.220]

Дифференциальное центрифугирование является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности. Но даже и в этом случае получаемые фракции никогда не бывают абсолютно гомогенными, и для их дальнейшего разделения применяют другие методы, описанные ниже (разд. 2.3., 2.3.2 и 2.3.3). Эти методы, основанные на различиях в плотности органелл, обеспечивают более эффективное разделение благодаря тому, что центрифугирование осуществляют в растворах с непрерывным или ступенчатым градиентом плотности. Недостатком этих методов является то, что приходится тратить время на получение градиента плотности раствора. [c.47]

Методика создания ступенчатого градиента плотности [c.50]

Для создания градиента плотности в центрифужную пробирку осторожно вносят при помощи пипетки несколько растворов с последовательно уменьшающейся плотностью. Затем на самый верхний слой, имеющий наименьшую плотность, наслаивают образец в виде узкой зоны, после чего пробирку центрифугируют. Получить плавные линейные градиенты можно за счет сглаживания ступенчатых градиентов при длительном стоянии раствора. Процесс можно ускорить, осторожно перемешивая содержимое пробирки проволокой или слегка покачивая пробирку. [c.50]

Образец вносят либо в виде узкой зоны, либо распределяют по всему объему колонки при создании градиента. Фракционирование идет наиболее быстро и эффективно в том случае, когда образец внесен вблизи зоны фокусирования. Для внесения в виде узкой зоны образец (при создании ступенчатого градиента) растворяют в одной или двух промежуточных фракциях рабочего раствора или (при создании плавного градиента) в рабочем растворе промежуточной плотности, вытекающем из смесителя. Плотность зоны образца не должна превышать плотность нижнего слоя рабочего раствора. Плотность слоев можно определить ориентировочно с помощью обычного сахариметра. При распределении образца по всему объему колонки белок растворяют в разбавленном, а иногда и в концентрированном растворах, приготовленных для построения градиента. В этом случае раствор с образцом следует отделить от верхнего и нижнего электролитов, соответственно разбавленным или концентрированным рабочими растворами. [c.310]

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна (например, для постановки RIA или ELISA), его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом — плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются примером может служить использование градиентов глицерина — тартрата калия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки. [c.100]

Ход элюирования регистрируют по изменению оптической плотности при 280 нм (или с помощью методов, описанных в разд. 1.2.2.1), элюат собирают по фракциям. Компоненты смеси, удерживаемые ионитом, элюируют, изменяя ступенчато или плавно ионную силу или pH рабочего буфера. Элюирование в ступенчатом градиенте приводит к появлению артефактов и вследствие этого применяется все реже. [c.42]

Для практических применений дугового разряда, так же как и тлеющего, наибольшее значение имеет положительный столб, составляющий главную по протяженности часть разряда. При пониженном давлении (миллиметры и десятые миллиметра ртутного столба) положительный столб дуги может не отличаться от столба тлеющего разряда составляющая его плазма также может быть неизотермичной. Однако при увеличивающейся силе и плотности тока возрастает концентрация электронов и вследствие этого появляется возможность ступенчатой ионизации. Поэтому компенсация потерь заряженных частиц в плазме может в этих условиях осуществляться более медленными электронами, иначе при более низкой электронной температуре. Иными словами, для поддержания стационарного состояния плазмы теперь необходимы ускоряющие электроны поля меньшей напряженности, т. е. более низкие градиенты потенциала. Это понижение и ведет к падающей вольт-амперной характеристике дуги (см. рис. 16), т. е. к уменьшению напряжения при увеличении силы тока. С другой стороны, при увеличении силы тока и повышении давления одновременно с понижением температуры электронов происходит повышение температуры газа, что связано с увеличением числа столкновений между электронами и молекулами газа и, следовательно, с все возрастающей отдачей энергии, набираемой электронами в электрическом поле плазмы, [c.47]

П. При использовании этого метода достигается хорошая очистка, но требуется более продолжительное центрифугирование. Примеси РНК, ДНК и некоторых белков за 16 ч равновесия не достигают и оказываются распределенными по всему градиенту. Данный метод обладает тем преимуществом, что градиент, в котором фаг концентрируется при равновесной плотности, оказывается гораздо более пологим, чем описанный выше ступенчатый градиент. Поэтому если препарат фага гетерогенен и содержит частицы с ДНК разной длины, то после центрифугирования можно обнаружить не одну, а несколько полос фага. [c.65]

Рис. 13.6. Изменение плотности теплового потока при одновременном ступенчатом изменении градиента давления и температуры стенки плоского канала ([/о=0, Рг—0,7)

Ресуспендируют ядра в 7 мл буфера для выделения и наслаивают на ступенчатый градиент плотности перкола, приготовленный из 7 мл 35%-иого перкола и 7 мл 80%-ного перкола, растворенного в буфере А для выделения ядер в стерильных силиконированных пробирках из корекса. Центрифугируют в бакет-роторе при 8000 g в течение 30 мин при 4 °С. Между двумя слоями будут располагаться ядра, свободные от клеточного дебриса, что контролируют с помощью окрашивания акридиновым оранжевым (приложение 2 [VII], В). Эту зону отбирают и разводят 25 мл буфера для выделения ядер. Ядра осаждают и еще раз промывают тем же буфером (1000 г, бакет-ротор). [c.257]

Очистка большого количества мембран лучше всего достигается разрушением клеток, насыщенных азотом, при быстрой декомпрессии с последующим дифференциальным центрифугированием полученного гомогената (Ferber et al., 1972). Везикулярные мембраны можно затем разделить на плазматические мембраны и эндоплазматическнй ретикулум изопнкннческим центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности фиколла (схема I). [c.54]

Рис. 2. Профиль сглаженного ступенчатого градиента плотности сразу после заполнения камеры (Miller, 1973).

Такое послойное смещение будет реально иметь место в том случае, если преформировать ступенчатый градиент плотности в пробирке углового ротора. Начнем, очевидно, с наслаивания растворов разной плотности в вертикально стоящей пробирке (рис. 67, а). Затем установим ее наклонно в ротор (рис. 67, б). Границы раздела слоев разной плотности, очевидно, останутся горизонтальными. По мере ускорения вращения ротора и нарастания центробежной силы более плотные слои жидкости будут стремиться занять наиболее удаленную от оси вращения часть объема пробирки, вытесняя оттуда менее плотную жидкость. Аналогичным образом поведут себя и остальные слои, в каждом случае уступая удаленную часть объема пробирки более плотному слою жидкости, в результате при достаточно большой скорости вращения ротора (когда центробежные силы во много раз превысят силу тяжести) все слои расположатся в том же порядке, что и вначале,, но границы между ними будут проходить вертикально (рис. 67, в). Произойдет переориентация слоев. [c.254]

Градиент плотности метризамида следует преформировать ступенчато за сутки до опыта, для того чтобы ступени имели возможность сгладиться за счет диффузии. Зато эти градиенты хорошо сохраняют свой профиль. Например, преформированный градиент метризамида может сохранять линейность (не отвечающую его равновесному распределению) в течение десятков часов центрифугирования. [c.272]

Для последующей очистки митохондрий осадок суспендируют в 2 мл среды выделения и. наносят на ступенчатый градиент плотности сахарозы, состоящий из следующих слоев 7 мл 1,1 М сахарозы, 15 мл 0,8 М сахарозы, 15 мл 0,5 М сахарозы и 10 мл 0,3 М сахарозы. Эти растворы готовят на 0,15 М калийфосфатном буфере при pH = 7,0, содержащем 5 мМ ЭДТА и 1 % альбумина. Градиент готовится предварительно и выдерживается на холоде в течение 2—3 ч. Центрифугирование материала в ступенчатом градиенте проводится в бакетном роторе при 7500 об/мин в течение 45 мин. [c.156]

При увеличении давления газа продольный градиент поля 8 положительном столбе увеличивается вследствие уменьшения длины свободного пути. При увеличении плотности тока продольный градиент уменьшается, но это уменьшение не всегда является простым следствием увеличения плотности тока, а часто происходит от увеличения температуры газа в положительном столбе, вызываюн1 его уменьшение плотности газа на пути разряда и увеличение средней длины свободного пробега. При прочих равных условиях увеличение плотности разрядного тока должно вести к уменьшению градиента потенциала в положительном столбе при наличии процесса ступенчатой ионизации, так как в этом случае концентрация электронов возрастает быстрее, чем пропорционально плотности тока. [c.278]

В настоящее время неясно, для чего нужен такой ступенчатый путь гликозилирования и какую роль играет в сортировке и транспорте белков. Как уже упоминалось, с помощью дифференциального центрифугирования в градиенте сахарозы удалось разделить аппарат Гольджи на 3 фракции (по-видимому, возможно получение и большего числа фракций, обладающих различной плотностью) и исследовать в каждой из них активность ферментов гликозилирования. Было показано, что фракция наиболее плотных мембран содержит ферменты, катализирующие присоединение к олигосахаридной цепи фосфатных групп, фракция с промежу- [c.179]

Для приготовления ступенчатого градиента 100%-ный маточный раствор перколла смешивают с ЗФР или сбалансированным солевым раствором (СР), чтобы получить 74%-ный (плотность 1,085), 68%-ный (1,080), 63%-ный (1,075) или 52%-ный (1,060) растворы перколла. 2 мл каждого из растворов последовательно (в соответствии с уменьшающейся плотностью) наслаивают в коническую пробирку на 15 мл. Наконец, клетки, ресуспендированные в 5 мл СР, наносят на градиент и центрифугируют 30 мин при 1400 g. Клетки, локализованные в более низкой зоне — между 74%- и 68%-ным перколлом, собирают и после двух-трех промывок СР используют для тестирования пролиферативной активности. При использованном методе выход этих клеток составляет 5—20% общего числа взятых клеток. [c.235]

I мл суспензии - 0,5 г СаС1). После растворения хлористого цезия нанесите фаговую суспензию на ступенчатый градиент СвС1 приготовленный на ЗМ буфере в нитроцел-лвлозных пробирках для ротора sw-28. Градиент состоит из трех ступеней, с плотностью 1,7 1,5 и 1,45 г/мл. Центрифугируйте 2 часа, 22 ООО об/мин при 4°С. а,говые частицы будут расположены на границе меаду слоями с плотностями 1,45 и 1,5 г/мл. [c.2]

Легко видеть, что средняя плотность раствора s l останется равной 1,7 г/см , но ступенчатое преформирование участков с нарастающей ко дну плотностью растворов в несколько раз сократит время формирования плавного равновесного градиента по всей пробирке. [c.252]

Рис. 13.5. Плотность теплового потока на стенке плоского канала при ступенчатом изменении градиента давления и 7 ст=сопз1 (начальная скорость жидкости Л/о=0, Рг=0,7)

Справочник химика 21

Химия и химическая технология