РНК окрашивание акридиновым оранжевым

Особый интерес представляет взаимодействие нуклеиновых кислот с некоторыми полициклическими ароматическими (основными) красителями, катионы которых имеют плоское строение. Примером таких соединений могут служить акридины (профлавин, акридиновый оранжевый и т. д.). Красители этого типа уже давно используются для окрашивания биологических объектов. Избирательно связываясь с ДНК или РНК, они переводят их в видимую форму. Этот эффект легко наблюдать по поглощению или флуоресценции красителей. В последнее время такие красители приобрели исключительно важное значение как мутагены, обладающие селективным действием, а именно способностью вызывать вставки или делеции (т. е. включение или выпадение единичных нуклеотидов) при репликации ДНК и таким путем специфически подавлять эту репликацию (см. стр. 492). [c.148]

Правильность выделения специальной группы реовирусов стала очевидной, когда в начале 60-х гг. обнаружили уникальные особенности структуры реовирусной РНК. Сначала заметили, что при окрашивании клеток, зараженных реовирусами, акридиновым оранжевым наблюдается флуоресценция в зеленой области спектра (ортохроматическая), а не в оранжевой (мета-хроматическая), характерной для одноцепочечной РНК. Акридиновый оранжевый обладает высоким сродством к одноцепочечным нуклеиновым кислотам и окрашивает их метахроматически. Поскольку к тому времени уже было известно, что реовирусы содержат РНК, был сделан вывод, что эта РНК двухцепочечная [107]. Дальнейшие исследования показали, что реовирусная РНК состоит из комплементарных цепей, образующих двойную спираль [102, 157]. Для нее характерны высокая температура плавления и малый температурный интервал денатурации, устойчивость к панкреатической рибонуклеазе и иная, чем у одноцепочечной РНК, плавучая плотность. Определение нуклеотидного состава реовирусной РНК показало, что она содержит одинаковое число пуриновых и пиримидиновых оснований. Двухцепочечный характер реовирусной РНК был подтвержден также данными рентгеноструктурного анализа [16, 102]. [c.266]

АКРИДИНОВЫЕ КРАСИТЕЛИ, применяют для окрашивания натур, телка и нек-рых нетекст. материалов н желтый (R = Н нли алкил) или оранжевый (R = арил) цвет. Важнейшие А. к.— основной желтый К (R = Н, R = СНз), основной же.чтый 3(R =R = H.i), акридиновый оранжевый (R = СбНз, R = И). Получ. копдеисациеН аром, л-диами- [c.17]

Но у него есть и важное преимущество окрашивание акридиновым оранжевым позволяет надежно различить полосы двунитевых (нативных) и однонитевых (денатурированных) нуклеиновых кислот. Проникая, подобно бромистому этидию, в двунитевые участки нуклеиновых кислот, акридиновый оранжевый при освещении ультрафиолетовым светом дает зеленую флюоресценцию (А тс=530 нм). В то же время электростатическое присоединение этого красителя к однонитевым участкам по остаткам фосфорной кислоты, в отличие от бромистого этидия, приводит к резкому изменению флюоресценции и смещению ее максимума в красную область (Яиа с = 640 нм). [c.152]

Методы прямого прижизненного окрашивания различных проб воды, почвы и осадков позволяют выделять гораздо больше живых клеток, чем высевы на различные среды. Большое расхождение в результатах прямого счета в сравнении с высевом на среды поставило вопрос прижизненно окрашенные микроорганизмы являются живыми или мертвыми Применение в качестве прижизненного красителя акридинового оранжевого показало, что часть клеток окрашивается с последующей зеленой флуоресценцией, часть — остается оранжевой. Это привело вначале к неверному выводу о том, что зеленые клетки — живые, а оранжевые — мертвые. Впоследствии было выяснено, что цвет флуоресценции зависит от отношения ДНК/белок в клетке, в результате активно делящиеся клетки выглядят зелеными, а растущие более медленно или покоящиеся клетки дают оранжевую флуоресценцию, оставаясь при этом живыми. [c.245]

Химические различия, выявляемые методами дифференциального окрашивания. Природа химических различий, выявляемых этими методами, еще только исследуется. Обычно обсуждаются две основные гипотезы так называемая ДНК-вая и белковая. Первая исходит из данных о том, что различные участки хромосом человека отличаются по количественному содержанию А—Т (аденин—тимин) и О—С (гуанин— цитозин) пар оснований. Акрихин-иприт связывается преимущественно с АТ-бога-тыми участками [466, 341]. Акридиновый оранжевый, соединяясь с одноцепочечной ДНК, дает красную флуоресценцию. После контролируемой денатурации К-сегменты окращиваются в красный цвет. На основании этих данных можно предложить [c.44]

Существует еще один метод, который может быть удобен для взятия проб в полевых условиях. В этом методе мембрану высушивают сразу же после фильтрации без ее окрашивания [55]. Позднее мембраны окрашиваются и вновь увлажняются прямо на стеклах для счета с помощью разбавленного раствора акридинового оранжевого. Такой способ исключает проблему переноса водных проб, взятых в полевых условиях, но, прежде чем применять его в конкретной обстановке, его необходимо проверять для надежности. [c.216]

Ресуспендируют ядра в 7 мл буфера для выделения и наслаивают на ступенчатый градиент плотности перкола, приготовленный из 7 мл 35%-иого перкола и 7 мл 80%-ного перкола, растворенного в буфере А для выделения ядер в стерильных силиконированных пробирках из корекса. Центрифугируют в бакет-роторе при 8000 g в течение 30 мин при 4 °С. Между двумя слоями будут располагаться ядра, свободные от клеточного дебриса, что контролируют с помощью окрашивания акридиновым оранжевым (приложение 2 [VII], В). Эту зону отбирают и разводят 25 мл буфера для выделения ядер. Ядра осаждают и еще раз промывают тем же буфером (1000 г, бакет-ротор). [c.257]

РНК. Исследование содержания РНК в клетке может быть проведенб с помощью акридинового оранжевого (АО) после селективной денатурации двуспиральной РНК. Используются несколько способов соответствующей цитохимической обработки клеток [4, 5]. При этом на однонитчатой денатурированной РНК АО образует димеры, которые в отличие от мономерной формы красителя флюоресцируют в красной области спектра. Мономеры АО интеркалируют в неповрежденную биспиральную ДНК, и по интенсивности их зеленой флюоресценции можно оценивать содержание ДНК. Таким образом, это по существу метод двойного окрашивания и измерения содержания РНК—ДНК по красно-зеленой флюоресценции АО. Применяется также способ определения содержания РНК с помощью пиронина V [6, 7]. [c.140]

Удержание РНК в фиксированных цитологических препаратах анализировали окрашиванием акридиновым оранжевым на каждом этапе предварительной обработки перед гибридизацией [8]. Полученные результаты показывают, что фиксация 2%-ным параформальдегидом обеспечивает более воспроизводимое удержание РНК, чем фиксация смесью этанол/уксусная кислота, предлагавшаяся в исходной методике. Прекрасное удержание РНК достигается при фиксации смесью метанол/ТХУ [9]. Глутаровый альдегид (0,2%-ный) в 0,1 М какоддлате натрия, используемый для фиксации криостатных срезов, также обеспечивает стабильное удержание РНК. [c.307]

Вышеуказанные методы не нашли широкого применения и потому, что был разработан более простой и более информативный способ определения активности рестриктаз, основанный на разделении продуктов реакции — фрагментов 3,НК, различающихся по длине, электрофорезом в агарозных гелях. В первых вариантах применения этого метода визуализацию разделенных фрагментов ДНК проводили авторадиографией [1821 или путем окрашивания акридиновым оранжевым [271]. Апробация с этой целью этидиума бромистого, дающего при освещении гелей УФ светом флуоресцирующие зоны ДНК, Шарпом с сотр. [241] продемонстрировала высокую чувствительность обсуждаемого способа детекции ДНК и способствовала повсеместному применению электрофоретического метода для оценки активности рестриктаз. [c.127]

П ш е н и ц а и я ч м е и ь. Не у всех злаков различие люминесценции срезов семян в зависимости от их жизнеспособности выражено отчетливо. В таких случаях пользуются другим приемом люминесцентного ана лиза — окраской флуоресцентными красителями. Так, жизнеспособность семян пшеницы, р ки и ячменя определяют после предварительного окрашивания Срезов зародышей флуорохромами, увеличиваюхцимп контрастность свечения зародыша и эндосперма. Для окраски срезов зародышей пшеницы применялся водно-спиртовой раствор родамина 6 ЖДН концентрации 0,00005—0,0001 г/сл , а для окраски срезов ячменя — содовый раствор (1% N33003) акридинового оранжевого концентрации 0,0003- - [c.233]

Пикок и Дингман [983] сравнили несколько основных красителей. Они обнаружили, что толуидиновый синий О, тионин и азур А не менее пригодны для окрашивания нуклеиновых кислот, чем метиленовый синий, который обычно использовали эти авторы. Окрашивание пиронином У, акридиновым оранжевым, алциановым голубым 8 GX, метиловым зеленым и галло-цианином в применявшихся авторами условиях давало менее удовлетворительные результаты. [c.384]

Марцинка [815] сравнил несколько красителей, применяемых для выявления нуклеиновых кислот, и сделал вывод, что для окрашивания РНК лучше всего использовать следующий метод. В смеси уксусной кислоты, метанола и воды (1 1 8 по объему) растворяют 0,5% пиронина Y и 1% ацетата лантана. В этом растворе гели выдерживают в течение 16 ч. Обесцвечивание фона проводят путем электрофореза в смеси уксусной кислоты, метанола и воды (1 2 17 по объему) или повторными промываниями гелей в нескольких сменах той же смеси. Окрашенные гели можно хранить в разбавленной уксусной кислоте (3—10%-ной) в течение нескольких лет. Описанный метод позволяет обнаруживать 0,01 мкг РНК. В идентичных условиях толуидиновый синий дает менее чистый фон, а акридиновый оранжевый — менее интенсивную окраску. [c.385]

Определенные затруднения возникают при окраске кислых фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию анионными красителями. Конечно, можно использовать такие положительно заряженные (катионные) красители, как толуи-диновый синий или акридиновый оранжевый (см. ниже), но они дают высокий уровень фона, так как матрица ПААГ всегда несет на себе некоторое количество отрицательно заряженных остатков акриловой кислоты. [c.94]

Среди красителей, широко использовавшихся до недавнего времени для окрашивания РНК в ПААГ, можно, кроме Stains-all , назвать также акридиновый оранжевый, метиленовый синий, толуидиновый синий и пиронин. Все они обладают одним общим недостатком окрашивание влечет за собой фотодеградацию молекул РНК. В тех случаях, когда этого необходимо избежать, например для последующей элюции РНК, окрашивать гель следует в темноте. [c.151]

Рабочая концентрация акридинового оранжевого при окрашивании гелей 30 мкг/мл (в 0,01 М. Na-фосфатном буфере, pH 7), а продолжительность окрашивания — около 30 мин. Отмывать фон самого геля можно в том же буфере в течение 2—3 ч при комнатной температуре (лучше в эмалированной кювете, поскольку эмаль сорбирует акридиновый оранжевый, который потом нетрудно отмыть горячей водой). Гель фотографируют при освещении ультрафиолетовым светом (А, = 254 нм) на цветную пленку, например Polaroid Туре 108 olor film . [c.152]

Пропись № 5. Анализ содержания ДНК—РНК [4, 5]. К 0.2 мл клеточной суспензии (2-10 клеток) прибавляется 0.5 мл раствора, содержащего 0.1 % (объем/объем) Тритона Х-100, 0.2 М сахарозы и 10 М ЕДТА в цитратно-фосфатном буфере (pH 3). Через 1 мин прибавляется 1 мл раствора, содержащего 0.002 % акридинового оранжевого (20 мкг/мл), и 0.1 М Na l в цитратно-фосфатном буфере (pH 3.8). Время окрашивания 5 мин при комнатной температуре. Анализ — сразу после окрашивания. [c.144]

Если к клеткам животных при митозе (когда хромосомы конденсируются) прибавить акридиновый оранжевый (АО), то использование для освещения света, возбуждающего АО, приведет к тому, что во флуоресцентный микроскоп хромосомы будут видны как ярко-зеленые зоны. Эту методику можно использовать для интерпретации следующего эксперимента. Существует прибор, позволяющий облучать маленькую часть клетки узким направленным пучком ультрафиолетовых лучей. Если часть хромосомы облучать таким пучком с диаметром, превышающим поперечное сечение хромосомы, то можно наблюдать одно из следующих явлений 1) хромосома остается ин-тактной, 2) при наблюдении в фазово-контрастный микроскоп облученная часть хромосомы выглядит бледной в сравнении с остальной частью, которая выглядит черной, 3) при наблюдении в интерференционный микроскоп с использованием белого свста облученная часть отличается по цвету от остальной части, 4) при добавлении АО облученная часть не флуоресцирует и 5) при окрашивании клетки красителем, дающим красный цвет в случае присутствия дезоксирибозы, облученная часть не окрашивается, тогда как вся остальная хромосома становится красной. [c.59]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология