Антигены диффузия

Принцип метода. Иммуноэлектрофорез представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с двойной диффузией и иммунопреципитацией в геле. Вслед за электрофоретическим разделением белков в агаровом геле навстречу полученным фракциям диффундирует специфическая иммунная сыворотка. Этот метод позволяет характеризовать белки не только по скорости миграции в электрическом поле, но и по антигенным свойствам. [c.137]

Гель-электрофорез. Электрофорез на геле и крахмале применяют для аналитических целей. Наиболее важным применением гель-электрофореза является иммуноэлектрофорез. Для этого вида анализа используют макропористые гели, в частности гели агара и агарозы. Метод иммуноэлектрофореза основан на том, что после разделения электрофорезом происходит диффузия разделенных веществ — антигенов — в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. Навстречу этим соединениям диффундируют антитела. При соединении антигенов и антител образуются характерные дуги осаждения. Метод иммуноэлектрофореза очень чувствителен при обнаружении антигенов, специфических для данных антител. В настоящее время применяют метод введения радиоактивной метки в антигены, благодаря чему радиоиммуноэлектрофорез является одним из самых чувствительных методов анализа биополимеров. [c.364]

К основным методам обнаружения реакций антиген — антитело относятся следующие а) реакции преципитации и агглютинации, в том числе образование линий преципитации, появляющихся на пластинках с агаровым гелем между лунками, содержащими антитела и антигены, которые движутся навстречу друг другу либо в результате простой диффузии, либо под действием электрического поля (при электрофорезе) б) реакция нейтрализации инфекционности вируса специфическим антителом [c.46]

Через определенный промежуток времени антиген диффундирует в агар. В условиях относительного избытка антигена в агаре образуется полоса преципитации, которая медленно мигрирует от границы, разделяющей агар и раствор антигена, в нижние слои агара. Миграция полосы обусловлена диффузией антигена в агаровом геле, в результате которой постепенно увеличивается концентрация антигена между полосой преципитации и верхней границей агарового слоя, т. е. выше так называемого фронта преципитации. С увеличением концентрации антигена происходит не только продвижение фронта преципитации вниз, но также и растворение преципитата у верхнего края полосы. [c.128]

Метод одномерной диффузии в агаре удобен главным образом для качественного анализа. По числу образующихся полос преципитации можно судить о минимальном числе разных антигенных компонентов, которые реагируют с антителами соответствующей специфичности в данной системе. [c.130]

Радиоиммуноэлектрофорез можно осуществить также и с помощью антигенов, меченных радиоактивными изотопами. Методика постановки подобна только что описанной, но после иммуноэлектрофореза в канавку для антисыворотки заливают меченный изотопом антиген (в приведенном выше примере — сывороточный Ч-альбумин человека) и оставляют для диффузии. [c.149]

Принцип метода. Это один из методов иммунодиффузии, в котором антиген и иммунная сыворотка мигрируют в геле навстречу друг другу не за счет диффузии, а под влиянием электрического поля. [c.154]

Область применения. Анализ антигенов, обладающих низким коэффициентом диффузии. [c.154]

Реакция преципитации в геле (агаре). Чашки заливают агаром, в котором вырезают несколько луночек на равном расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные — различные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. При диффузии реагентов в агаре в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы —дуги преципитации (рис. 58). [c.116]

В своей классической форме иммуноэлектрофорез представляет сочетание электрофореза в агаровом (или агарозном) геле с последующей двойной иммунодиффузией в той же среде. При двухмерной двойной иммунодиффузии антиген и антитело, помещенные в круглые или прямоугольные углубления в геле, мигрируют навстречу друг другу, в результате чего в нейтральной зоне среды, где они встречаются, образуются линии преципитации (рис. 82). Положение полос преципитации зависит от коэффициента диффузии антигена (скорость диффузии антитела можно рассматривать как постоянную) и концентрации антигена относительно антитела. Существует определенный интервал концентраций антигена и антитела, в котором их соотношение является оптимальным для образования преципитата. При двойной иммунодиффузии в этом интервале относительных концентраций (называемом зоной эквивалентности) получаются четкие линии преципитации. [c.236]

Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии 203, 394]. [c.244]

Рис. 4.7. Результаты, полученные методом связывания комплемента, с одной стороны, и методом двойной диффузии, с другой стороны, для сравнения антиген ности р-амилаз, экстрагируемых из непроросшего и пророс него зерна ячменя. В двух упомянутых методах использована одна н та же моноспецифическая иммунная сыворотка р-амилазы ячменя. Оба экстракта подвергли диализу и разбавили >1.0 получения одинаковой их активности.

Необходимым условием для осуществления гомогенного иммуноанализа такого типа, по-видимому, является различие в коэффициентах диффузии между свободным меченым антигеном и антигеном, связанным с антителами. Следовательно, такие мето- [c.218]

Поскольку биораспознающая поверхность является твердой фазой, структура пограничного слоя на ее поверхности влияет на реакцию и достижение стационарности. Хотя термин концентрация не очень подходит для рассмотрения фазы иммобилизованного реагента в растворе, однако в граничном слое локальная концентрация иммобилизованного реагента очень высока. Рассмотрим, к примеру, иммобилизованное на поверхности антитело в растворе, содержащем антиген (рис. 7.9-8). Антиген связывается с иммобилизованным антителом, вызывая обеднение антигеном слоя, ближайшего к поверхности, которое восполняется антигеном из объема раствора, причем процесс этот ограничен диффузией. [c.575]

Молекулы липидов и белков, входящих в состав мембран, способны перемещаться друг относительно друга. Скорость латеральной диф фузии липидов в бислоях и антигенов (белков) на поверхностях клеток весьма высока. Если предположить, что диффузия фосфолипидав-происходит за счет взаимного обмена соседних молекул, то частота таких обменов может достигать 10 с [24]. [c.348]

Б. В Иммуноэлектродиффузия или ракетный иммуноэлектрофорез [66], Гель агарозы содержит равномерно распределенную иммунную сыворотку. В лунки внесены антигенные растворы разных концентрации. Электрофоре. проводится при pH, при котооом антитела не мигрируют либо мигрируют очень мало. Антигены под действием электрического поля мигрируют в геле, содержащем антитела. Комплексы при избытке антигенов вначале растворимы, продолжают мигрировать в ходе электрофореза, а также посредством диффузии, обогащаются антителами, н, когда соотношение антигенов и антител достигает точки эквивалентности, они осаждаются в форме ииков. [c.102]

Б. Двойная диффузия специфические преципитаты, соответствующие экстрактам из иепроросших зерен (левая луика) и нз проросших (правая лунка), образуют непрерывную линию и не выявляют различий в антигенах, тогда как они четко выявляются другим методом [211. [c.104]

Примечание. Этап фиксации гистологических препаратов очень важен. Белки должны фиксироваться так, чтобы исключить их диффузию в другие клеточные или субклеточные компартмеиты. К тому же фиксация не должна нарушать антигенную структуру белка и препятствовать доступу антител к антигенам за счет образования более или менее проницаемой молекулярной сети. Кроме того, представляется, что в некоторых семенах доступ антител к антигенам может сильно ограничиваться в некоторых ткаиях или субклеточных компартментах [44, 271- [c.106]

Попытки разработать методы иммунодиффузии, позволяющие количественно оценивать содержание антигенов и антител, делались неоднократно. Одна группа таких методов основьгоается на двойной диффузии в геле по Ухтерлони (см. стр. 131), другая — на измерении скорости диффузии и степени мутности полос преципитации при иммуноэлектрофорезе (стр. 137). Пока эти методы еще не получили широкого распространения. [c.157]

Принцип метода. Исследуемый антиген подвергают электрофорезу на ацетат-целллюлозной мембране. После этого на мембрану наносят специфическую иммунную сыворотку, и в результате ее диффузии образуются полосы преципитации, выявляемые при окрашивании. [c.162]

Реакция встречного иммуноэлектрофореза (РВИЭФ). Эта реакция основана на встречной диффузии в электрическом поле антигенов и антител и появлении внутри прозрачного геля видимого преципитата. В агаровом или агарозном геле делают лунки диаметром 2 — 3 мм, причем расстояние между лунками для сыворотки и АГ должно составлять 5 — 6 мм. Лунки располагают попарно (одна — для АГ, вторая — для сыворотки) или по три (одна — для АГ, вторая — для испытуемой сыворотки, третья — для контрольной сыворотки). Лунки для сыворотки располагают ближе к аноду, а для АГ — к катоду. Реакцию проводят с несколькими разведениями АГ, продолжительность электрофореза — 90 мин. Результаты реакции учитывают сразу же после окончания электрофореза, отмечая количество и локализацию линий преципитации при сравнении их с контрольной тест-системой. [c.69]

В ряду с осмотическими процессами находится диализ, когда происходит непрерывная диффузия малых молекул в циркулирующий растворитель с удерживанием больших молекул. При этом отсутствует выраженный перенос растворителя против градиента концентрации. Диализ применяют, например, при очистке антигенных препаратов, представляющих собой протеины, гликопротеины или более сложные комплексы. С помощью диализа через раличные мембраны освобождаются от неорганических солей. [c.391]

В качестве поддерживающей среды можно применять и агаровый гель, но размер пор в нем гораздо больше, и движение белковых частиц происходит беспрепятственно (гель с низкой разрешающей способностью ). Большая скорость диффузии и прозрачность геля были использованы Грабаром и Уильямсом, которые создали так называемый иммуноэлектрофорез , являющийся развитием ранее существовавшего метода имму но диффузии . Суть иммуноэлектрофореза состоит в том, что для проявления электрофореграммы и идентификации белковых компонентов применяется преципитация их иммунной сывороткой крови. После предварительного электрофореза на бумаге из последней вырезают продольную полоску, не проявляя зон. Еще влажную бумагу прижимают к поверхности агарового геля. Параллельно этой полоске вырезают канавку в агаре и наливают в нее иммунную сыворотку. В результате встречной диффузии антитело встречается с антигеном происходит преципитация, и в прозрачном геле образуются дугообразные ясно видимые полосы, которые можно еще окрасить. [c.99]

После окончания электрофореза в канавку О, ирорезанную вдоль агарового блока на расстоянии порядка 1 см от нанесенного в начале образца белка А, заливается иммунная аптисы-воротка к исследуемой белковой смеси. Весь блок помещается на длительное время (7—14 суток) в сосуд, в котором поддерживается насыщенная упругость паров воды. Антитела диффундируют навстречу антигенам и дают при достижении критического интервала концентраций, благоприятного для преци-питиповой реакции, видимые глазом осадки в форме тонких дуг. Подобная форма осадков вполне понятна. В тех областях агара, где концентрация белка после электрофореза максимальна, точка выпадения осадка будет наиболее удалена от канавки, заполненной антителами, так как самая низкая концентрацпя антител в поле диффузии окажется достаточной, чтобы вызвать преципитацию. В других точках зоны, в которых концентрация белка ниже максимальной, выпадение осадка произойдет ближе к канавке с антителами. Отсюда картина дугообразных преципитатов. [c.136]

В методе иммунодиффузии наблюдается полоса преципитадии при диффузии препарата в гель, содержащий антитела. Каждая система антиген—антитело образует свою полосу. Диффузия может быть проведена в тонкой пленке геля или в вертикальных трубках. При помощи иммунофореза можно разделить очень сложную смесь близких по физико-химическим свойствам гликопротеинов. Первоначально проводится электрофорез в агар-агаровом геле, а затем иммунодиффузия ( перпендикулярном направлении). [c.75]

В опытах по иммунодиффузии раствор исследуемого препарата отделен от антисыворотки зоной геля, в который и препарат, и антисыворотка могут диффундировать (двойная диффузия). По другому способу раствор антигена диффундирует в гель, в котором уже находятся антитела (одиночная диффузия). С течением времени концентрация реагентов становится достаточно высокой для специфической преципитации, и в том месте, где это произошло, линия или полоса преципитации становится видимой. В общем случае каждая система антиген — антитело образует отдельную полосу. Для решения специфических вопросов преципитации разработано большое число различных экспериментальных приспособлений двойную диффузию обычно проводят в чашках Петри или (в меньших масштабах) в тонкой пленке геля на предметном стекле. Полосы можно сделать более заметными путем окрашивания. Одиночную диффузию удобнее проводить в маленьких вертикальных трубочках. Недавно Охтерлони [68] опубликовал обзор с исчерпывающей библиографией, охватывающей все аспекты иммунодиффузионного анализа. Очищенный препарат следует проверить в опытах по одномерной или двумерной диффузии при возможно большем числе концентраций препарата [69]. Появление одиночной полосы с обеими антисыворотками является доказательством гомогенности препарата. Однако гомогенный препарат не обязательно должен давать одиночную полосу. Имеется несколько причин, которые могут вызвать образование двойной полосы и в случае гомогенного антигена. Это может объясняться недостаточным контролем температуры или осаждением, напоминающим кольца Лизеганга, при использовании определенных типов антител, если применяется очень сильная неразбавленная антисыворотка. Более того, установлено, что гомогенный антиген, имеющий несколько антигенных детерминантов, может дать несколько полос преципитации. Эти вопросы обсуждены Кроуле [70] и Фингером [71]. Тем не менее гетерогенность является наиболее обычной причиной двойных или множественных полос нрецииитации. Следует иметь в виду, что неантигенные компоненты нельзя определить этим методом, и нужно также отметить, что примеси, дающие перекрестную реакцию, не будут найдены, если их скорость диффузии меньше, чем у гомологичного антигена [72]. Это обычно не вызывает осложнений, за исключением случаев, когда компонент, дающий перекрестную реакцию, сам является довольно сильным антигеном и может порождать свое собственное антитело, [c.53]

Самым распространенным методом определения антигена и антител является преципитация в агаре (реакция двойной диффузии в геле по Оухтерлони). Преимуществами данной реакции являются относительная простота, высокая специфичность, отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных ответов, небольшой расход материалов и возможность определения полноты антигенной идентичности. Недостатками реакции являются низкая чувствительность, длительность получение предварительного ответа через 24 ч, а окончательного—лишь спустя 48—72 ч. Для исследования берут кровь больного в количестве, необходимом для получения 0,3 мл сьшоротки. Реакции ставят на пластинах, в 1% агаре, в котором вырезают лунки для ингредиентов реакции. В качестве тест-системы используют стандартный австралийский антиген и соответствующую специфическую антисьшоротку. Учет реакции проводят через 1—3 дня по появлении дуг преципитации между лунками. [c.248]

Кроме метода титрования существуют и другие способы количественного определения антигенов путем иммуноэлектрофореза. Был описан метод, основанный на принципе простой иммунодиффузии f80, 81, 1962], при которой углубления для антигенов и антител примыкают непосредственно друг к другу. Антиген, находящийся в одной части геля, диффундирует в другую, содержащую антитела, и на границе этих двух частей образуется линия преципитации. Первичная зона преципитации растворяется затем в избытке антигена, продолжающего поступать благодаря диффузии в ту часть геля, где находятся антитела. Растворимые комплексы антиген-антитело вновь преципи-тируют при реакции с антителами в прилежащей зоне геля. Описанная последовательность событий — преципитация, растворение и повторная преципитация — создает впечатление, что преципитат движется. Путь, пройденный передним краем преципитата за тот или иной период времени, может служить мерой для определения концентрации антигенов. При этом в качестве стандартов необходимо использовать образцы с известной концентрацией антигена. При количественном иммуноэлектрофорезе для проведения простой иммунодиффузии разделенных компонентов в геле вырезают широкую канавку, непосредственно примыкающую к лунке с антигеном (рис. 85), и заполняют [c.240]

В целом аллергены, проникающие в организм через дыхательные пути, характеризуются следующими особенностями (I) все они являются белками, относящимися к категории Т-зависи-мых антигенов (2) их высокая растворимость в условиях влажной среды дыхательных путей способствует быстрой диффузии из вдыхаемых частиц (3) низкий молекулярный вес обеспечивает им относительно свободное проникновение в слизистую, (4) низкая провоцирующая доза благоприятствует включению в ответ хелперных D4 Т-клеток продукция этими клетками интерлейки-на-4 обеспечивает переключение синтеза иммуноглобулинов в В-клетках на IgE. [c.358]

Принцип разделения компонентов в анализе с применением микрокапсулированных антител основан на том, что продиффун-дировавший внутрь капсулы и связавшийся с антителами меченый антиген теряет способность переходить обратно в раствор вследствие ограниченного размера пор. Как следует из принципа разделения, микрокапсулирование для целей анализа не является универсальным подходом. Эффективное применение таких препаратов антител возможно только при использовании в анализе низкомолекулярных антигенов, меченных небольшими по размерам метками (изотоп, кофактор), что обеспечивает свободную диффузию конъюгата антиген — маркер внутрь капсулы. [c.212]

После того как идентифицирован изотип, можно определить количество иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой. Соответствующую типирующую антисыворотку смешайте с агаром (табл. 4.14). Добавьте концентрированный раствор супернатап-та гибридомы в лунку для антигена в агаровом слое. По мере диффузии антигена из лунки в агар вокруг лунки образуется кольцо преципитата антиген-антитело. Измерьте диаметр кольца и по стандартной кривой определите количество внесенного в лупку антигена. После получения агаровых пластинок присту- [c.157]

Широко используемый метод двойной диффузии в агаре предложенный О. Ухтерлони (О. ОисЬ1ег1опу, 1948), состоит в том, что антиген (ы) и антитело a) помещают в лунки, проделанные в топком слое геля на [c.254]

Помимо выявления аитигенной неоднородности метод двойной диффузии в геле позволяет сравнить антигенное строение нескольких веществ и выявить наличие сходства и различий между ними. Как всякий иммунологический метод, метод двойной диффузии в геле имеет ограничения, основное из которых — спектр антител в исследуемой антисыворотке. Так, в ранних работах при сравнительном изучении антигенного строения IgG кролика и его Fab- и F -фрагментов использовали антисыворотку против IgG кролика, полученную от коз. Исследователям не было тогда известно, что животные этого вида не образуют практически антител против детерми-Бант Fab-участка молекулы. Поскольку при использовании этой антисыворотки F -фрагмент давал реакцию антигенной идентичности с нерасщепленной молекулой IgG, сделали ошибочное заключение об отсутствии в РаЬ-участке видоспецифических антигенных детерминант. Ошибка была исправлена после исследования фрагментов молекулы IgG с помощью антииммуногло- булиновых сывороток, полученных от животных других видов, в антисыворотке осла против IgG кролика содержится примерно равное количество антител против антигенных детерминант Fab- и F -участком. На этом примере можно еще раз убедиться в необходимости использования при антигенном анализе антисывороток, полученных от животных разных видов (см. гл. 2). [c.255]

В этом отношении эффективны такие методы, как двойная диффузия по Ухтерлони (наименее чувствительный метод), иммуноэлектрофорез (для индивидуального антигена или смеси антигенов), ракетный ИЭФ (для индивидуального антигена) и двумерный ИЭФ (для определенного антигена или смеси. антигенов). Данные методы описаны в гл. 6. На рис. 2.1 при- [c.55]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология