Лидирующие красители

Проведение электрофореза. Разделение можно проводить как в трубочках (с. 95), так и на пластинах для вертикального электрофореза (с. 97). После обработки ДСН к образцам добавляют сахарозу (до концентрации 10%) и в качестве лидирующего красителя — бромфеноловый синий (до концентрации 0,001%). Образцы исследуемых белков и белков-маркеров наносят на поверхность геля в объеме от 20 до 100 мкл (каждого или смеси нескольких образцов) и осторожно наслаивают электродный буфер. Нагрузка на гель определяется методом окраски гелей, а также способностью того или иного белка связывать используемый краситель. Как правило, при электрофорезе в трубочках удается обнаружить от 20 до 100 мкг белка, при электрофорезе в пластинке — от 4 до 15 мкг. В электродный буфер катодного отделения добавляют ДСН до концентрации 0,1%. Электрофоретическое разделение проводят при комнатной температуре и силе тока 8 мА на трубочку. При этом сначала устанавливают силу тока - [c.120]

Обработка электрофореграмм. Определяют расстояние, пройденное каждым белком от стартовой линии. Определение можно проводить визуально или с помощью денситометра при 550—600 нм. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс длину пути 1а, пройденного данным белком, а по оси ординат — логарифм его молекулярной массы. Определив длину пути, пройденного белком с неизвестной молекулярной массой 1х, пользуясь калибровочным графиком, определяют молекулярную массу исследуемого белка. При проведении электрофореза в трубочках часто трудно получить хорошо воспроизводимые результаты на разных трубках. В этом случае определяют не абсолютную, а относительную подвижность белков. Для этого определяют отношение длины пробега белковой зоны либо к общей длине геля, либо к длине пробега лидирующего красителя. После этого строят зависимость относительной подвижности белков от логарифма их молекулярной массы. [c.121]

Электрофоретическое разделение проводят в течение 60—90 мин при напряженности электрического поля 4—5 В/см или силе тока 5 мА на трубку. В качестве лидирующего красителя используют рас- [c.173]

Как уже подчеркивалось, препарат должен быть заведомо свободен от пыли, нерастворенных белков и других частиц. После внесения препарата в трубку или карман пластины на 5— 15 мин включают напряжение, пониженное примерно вдвое против расчетного. За это время лидирующий краситель должен полностью войти в гель. Такая процедура улучшает условия формирования исходной белковой полосы в геле. Затем переходят на расчетный режим электрофореза по напряжению и силе тока. [c.53]

С поверхности заполимеризовавшегося концентрирующего геля удалить воду и внести образец (смесь изоферментов ЛДГ, разведенную 40 %-ным раствором сахарозы в отношении 1 1) в количестве 0,2 мл. Наслоить раствор лидирующего красителя (0,001 %-ный раствор бромфенолового синего). Эта часть колонки непосредственно соприкасается с электродным буфером при электрофорезе, поэтому верхнее наслаивание заканчивается электродным буфером. Наслаивание проводят очень осторожно, избегая перемешивания образца с буфером, во избежание потери вещества. [c.272]

Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47]

На строго горизонтальную поверхность пластины ПААГ быстро выливают расплавленный 0,5%-ный раствор агарозы в СФБ, чтобы получить слой толщиной 1 мм. Предварительно агарозу смешивают при 56° с разбавленной специфической антисывороткой. После застывания геля агарозы такую двуслойную пластину выдерживают при 37° во влажной камере 2—6 ч, в зависимости от размера молекул антигена, диффундирующих из ПААГ в агарозу. Затем, отметив на пленке агарозы положение лидирующего красителя в рабочем ПААГ, ее снимают, покачивая пластинку в СФБ. Пленка агарозного геля легко отделяется от ПААГ. Одновременно с диффузией в гель агарозы идет им-мунохимическая реакция антигенов с находящимися в геле антителами и образование преципитатов. Пленку вымачивают в течение 4 ч в том же буфере, удаляя из нее не прореагировавшие иммуноглобулины антисыворотки и белки неантигенной природы, перешедшие туда из ПААГ. Преципитировавшие иммунные комплексы с участием искомого антигена можно окрасить обычными способами или обнаружить методом авторадиографии, если антиген или антитела несут радиоактивную метку. Отметим, что преципитация здесь требует подбора концентраций и довольно значительного времени диффузии антигенов в агарозу для обеспечения эквивалентного соотношения концентраций антител и антигена. [c.129]

М мочевины часто используют для электрофоретического фракционирования гистонов [Рапу1т, СЬа1к1еу,- 1969]. Молекулярные массы гистонов лежат в диапазоне 11—22 тыс. дальтон, поэтому для их разделения используют мелкопористые гели (7 = 15 -20). Положительно заряженные в кислой среде гисто-ны мигрируют в направлении катода. Наибольшей подвижностью обладает гистон Н4, затем следуют Н2А, Н2В и НЗ, которые в этой простой системе разделяются довольно плохо. От них заметно отстает относительно более крупный гистон Н1. В качестве лидирующего красителя используют пироиии. [c.55]

В другой работе [Howard, Traut, 1973] разделение рибосомальных белков по заряду в первом направлении вели тоже в 4%-ном ПААГ в присутствии 6 М мочевины, но в 0,4 М Трис-боратном буфере, pH 8,7. При этом pH часть белков рибосом оказывается заряженной отрицательно, а другая часть —положительно. Белковый препарат смешивали с расплавленной 1%-ной агарозой и вносили в середину трубки, наслаивая его на заполимеризованный нижний участок ПААГ. После затвер-девания агарозы в трубку заливали новую порцию смеси моно меров и полимеризовали верхний участок ПААГ. При этом в интересах концентрирования полос на обеих границах с ПААГ агарозу с белковым препаратом полимеризовали в разбавленном (0,06 М) Трис-боратном буфере. При включении напряжения миграция белков шла в обе стороны —к катоду и аноду. Во втором направлении разделение белков вели по их размерам, но без обработки ДДС-Na. Для этого использовали пластину еще более мелкопористого геля, чем в предыдущей работе (Т= = 18,25 С=1,37), полимеризованного в 0,9 М уксусной кислоте, титрованной КОН до pH 4,5, также с добавлением 6 М мочевины. В этом случае все белки были заряжены положительно и мигрировали к катоду. В качестве лидирующего красителя использовали 0,1%-ный раствор пиронина. Из цилиндрика геля [c.79]

В качестве лидирующего красителя при фракционировании рибосомальных белков в кислом буфере недавно было предложено использовать Fe U. Ионы Fe + в присутствии уксусной кислоты образуют стойкие комплексы коричневого цвета, мигрирующие к катоду впереди самого мелкого из рибосомальных белков (Bernabeu et al., 1979]. [c.80]

В качестве рабочего буфера геля использовали 0,1 М Na-фосфат (pH 7) с и,1% цетавлона. Белковый препарат перед электрофорезом денатурировали в течение 1 мин на кипящей водяной бане в том же буфёре, но содержащем 0,5% цетавлона и 10—15% i -меркаптоэтанола. Лидирующий краситель — малахитовый зеленый. Электрофорез в 10%-ном ПААГ при силе тока 8 мА на трубку (10X0,6 см) занимал около 5 ч. Белки фиксировали в кипящей 10%-ной ТХУ, затем окрашивали при комнатной температуре 0,57о-ным раствором СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% этанола, в течение 10 ч. [c.86]

В качестве лидирующих красителей при электрофорезе нуклеиновых кислот используют бромфеноловый синий и ксиленцианол. Следует только иметь в виду, что в крупнопористых гелях агарозы малые фрагменты ДНК могут обгонять даже бромфеноловый синий. [c.126]

Если исходный раствор нуклеиновых кислот был сильно за-буферен, его надо предварительно подтитровать щелочью. Бромфеноловый синий в щелочной среде постепенно обесцвечивается, поэтому его следует вносить в исходный препарат непосредственно перед началом электрофореза. Еще лучше в качестве лидирующего красителя в этом случае использовать бромфеноловый зеленый. Он устойчив к воздействию щелочи, а по электрофоретической подвижности сходен с бромфеноловым синим. [c.130]

Окрашивание ведут в течение 16 ч. Отмывают гель в той же смеси, но в пропорции 0,5 1 8,5, либо за счет дИффузии, либо электрофоретически. Однако фон окраски полностью не отмывается, и в этом отношении предпочтение следует отдать окрашиванию РНК пиронином. Пиронин используется как для окрашивания РНК, так и в качестве лидирующего красителя, поэтому [c.152]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология