Экзонуклеазная активность при репарации ДНК II рис

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков (а. а.) (Air=102 000 D). Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. соИ наличием З -экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I — это два фермента на одной полипептидной цепи ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфрагмент ДНК-полимеразы I (называемый также ДНК-полимеразой Кленова или фрагментом Кленова) обладает полимеризующей и З -экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет З -экзонуклеазную активность, 5 -экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5 -конец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5 -экзонуклеазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза расчищает дорогу для полимеразы (рис. 29). Подобные свойства ДНК-полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной поли- [c.48]

Pol I и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК Е. соИ. 3 -5 -экзонуклеаз-ная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи (рис. 2.15). Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем Pol I, то при репликации генома часто происходят мутации-замены оснований. [c.78]

Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. У бактерий РНК-затравка удаляется нуклеотид за нуклеотидом благодаря 5 -> З -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. При этом каждый отщепленный рибонуклеотидный мономер замещается соответствующим дезоксирибонуклеотидом (в качестве затравки используется З -конец синтезированного на старой цепи фрагмента). Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З -ОН нового фрагмента ДНК и 5 -фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, к-рая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента-никотинамидадениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов). [c.253]

Поврежденный участок ДНК вырезается и застраивается заново с использованием комплементарной цепи в качестве матрицы. > Е. сэИ ДНК-полимеразой, участвующей в репарации, служит ДНК-полимераза I. В ряде случаев этот же фермент может выполнять функции экзо-иуклеазы за счет своей о -> З -экзонуклеазной активности) [c.77]

Описанные выше варианты направленной стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК основаны на особенностях действия используемых ферментов. Так, ДНКаза I в присутствии ионов марганца производит разрыв обеих цепей ДНК с образованием или тупых концов, или с небольшим количеством выступающих нуклеотидов, легко поддающихся репарации. Этот же фермент в присутствии интеркалирующего красителя бромистого этидия делает так называемые ники в виде одиночных разрывов одной цепи ДНК. Специфичная к однонитевой ДНК S1 нуклеаза применяется для разрыва второй цепи ДНК в месте образовавшегося ника или целого участка одноцепочечной ДНК, сформировавшегося после расширения ника с помощью экзонуклеазы III. Для этой же цели используют и другую нуклеазу Ва131, обладающую относительно слабой эндонуклеазной активностью, специфичной для однонитевой ДНК. (Более сильная экзонуклеазная активность этого фермента позволяет деградировать двуцепочечные участки ДНК). Еще один фермент - экзонуклеаза III, используемый вместе с другими ферментами (нуклеазами) в некоторых из упомянутых выше способах для удаления одной цепи ДНК, начиная с ника увеличивает в направлении 3 5 участок одноцепочечной ДНК. [c.256]

Также была предложена оригинальная стратегия получения делеционных вариантов субклонов, основанная на применении все той же экзонуклеазы III [Henikoff, 1990]. Суть этой стратегии заключается в образовании сначала двуцепочечной структуры из одноцепочечного фага М13 или ему подобного и уже затем создании делеций. Так, на первом этапе проводится отжиг олигонуклеотидного праймера, расположенного таким образом, чтобы ДНК-полимеразой при удлинении праймера в первую очередь была скопирована сама векторная последовательность. Построение цепи ДНК осуществляется с помощью ДНК-полимеразы фага Т4, поскольку этот фермент характеризуется высокой скоростью полимеризации, не несет 5 — 3 -экзонуклеазной активности и не вызывает смещение цепей как некоторые другие ДНК-полимеразы. В результате образуется двуцепочечная молекула ДНК, несущая один ник между 5 -концом праймера и 3 -концом вновь синтезированной цепи ДНК. Далее в действие вступает экзонуклеаза III, работающая в обратном направлении и расширяющая ник до весьма протяженных участков одноцепочечной ДНК. Отбор аликвот данной реакции по времени расщепления приводит к формированию некоторого пула молекул с одноцепочечными участками различной протяженности. После удаления образовавшихся одноцепочечных участков S1 нуклеазой, репарации концов и их лигирования проводится трансформация компетентных клеток E. oli полученными конструкциями. Таким образом, как можно видеть из рис. 8.12, в результате всех этих процедур об- [c.259]

Нри репликапии ДНК две пепи двойной спирали расплетаются и расходятся по мере того, как синтезируются новые пепи. Каждая родительская пепь служит матрицей для образования новой комплементарной цепи. Таким образом, репликация ДНК полуконсервативна - каждая дочерняя молекула получает одну цепь родительской молекулы ДНК. Репликация ДНК-сложный процесс, в осуществлении которого участвует много белков, в том числе ДНК-полимеразы трех типов и ДНК-лигаза. Активированные предшественники синтеза ДНК-четыре дезокси-рибонуклеозид-5 -трифосфаты. Новая цепь синтезируется в направлении 5 —>3. Этот синтез осуществляется путем нуклеофильной атаки внутреннего атома фосфора очередного дезоксинуклеозидтрифосфата 3 -гидроксильным концом цепи затравки. Самое важное состоит в том, что ДНК-по-лимераза катализирует образование фосфодиэфирной связи только в том случае, если основание очередного нуклеотида комплементарно основанию матричной цепи. Другими словами, ДНК-полимеразы — ферменты, направляемые матрицами. ДНК-полимеразы I, II и III обладают также 3 —>5 -экзонуклеазной активностью, которая увеличивает надежность репликации путем удаления не комплементарных остатков. ДНК-полимеразам I и Ш присуща, кроме того, 5 —>3 -нуклеазная активность, играющая важную роль в механизмах репликации и репарации ДНК. [c.43]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология