Дезоксинуклеозидтрифосфаты

ДНК-полимеразной реакции (рассуатриваемой в гл. II при обсуждении репликации ДНК). Принцип метода показан иа рис. 7. Как и при секвенировании ДНК по Максаму — Гилберту, здесь добиваются, чтобы обрыв цепи (при попадании на ее З -конец комплементарного терминаторного нуклеотидного остатка) происходил равновероятно по всем положениям данного остатка (рис. 7 — остаток Т). Это достигается экспериментальным выбором правиль ного соотношения дезоксинуклеозидтрифосфатов и терминаторного [c.18]

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза. Терминальная трансфераза (добывается из тимуса теленка) способна наращивать на концах фрагментов ДНК однонитевые участки путем последовательного присоединения к З ОН-концам обеих нитей нуклеотидных остатков из тех дезоксинуклеозидтрифосфатов, которые [c.185]

В др. случае (метод Сенгера) используют олиго- или полинуклеотидную затравку (праймер) известной длины, коплементарную определенному участку Н.к. Затравку наращивают с помощью ДНК-полимеразы, останавливая синтез на одном из четырех типов нуклеотидных остатков с равной вероятностью, независимо от его положения в цепи. Для этого к смеси четырех прир. субстратов ДНК-полимеразы добавляют т.наз. терминатор (обычно 2, З -ди-дезоксинуклеозидтрифосфат)-аналог определяемого нуклеотидного остатка, попадание к-рого на З -конец растущей цепи останавливает синтез. При этом радиоактивная метка вводится либо в затравку, либо в субстрат. Операгщю Повторяют для каждого из четырех нуклеотидов длину образующихся радиоактивных фрагментов определяют стандартным способом. Эти методы в настоящее время удалось полностью автоматизировать (заменив в ряде случаев радиоактивную метку на флуоресцентную) и тем самым в тысячи раз повысить скорость секвенироваиия ДНК. [c.299]

Р. способны катализировать превращения фосфоэфиров нуклеозидов всех четырех типов (аденозина, гуанозина, уридина, цитидина) содержатся во всех живых организмах, как в цитоплазме, так и в ядре. С участием Р. реализуется осн. путь биосинтеза дезоксинуклеозидтрифосфатов-предшественников ДНК. [c.264]

Ключевую роль в процессе репликации играют реплицирующие ДНК-полимеразы, которые осуществляют матричный синтез ДНК из дезоксинуклеозидтрифосфатов. Фермент синтезирует нить ДНК, комплементарную родительской нити (называемой матрицей), последовательно присоединяя к З -концу растущей цепи мононуклео-тидные звенья, комплементарные звеньям матрицы (рис. 230). При этом ДНК-полимераза катализирует нуклеофильную атаку З -ОН-группы концевого нуклеотида растущей цепи иа а-фосфатную группу дезоксинуклеозидтрифосфата, отбираемого ферментом на основе его комплементарности соответствующему звену матрицы. В результате отщепляется пирофосфат и образуется фосфодиэфирная саязь. Растущая цепь удлиняется на одно звено, и процесс повторяется с новым дезоксинуклеозидтрифосфатом. Для того чтобы ДНК-полимераза могла начать синтез, необходимо существование уже готового фрагмента ДНК или РНК, комплементарного матрице и содержащего свободную З -ОН-группу. Этот фрагмент называют затравкой. В процессе синтеза дочерних цепей родительская даух-цепочечная ДНК расплетается, образуя структуру, по форме напоминающую латинскую букву Y. Такая структура называется репликативной вилкой. [c.407]

Последующими экспериментами было доказано, что репликация ДНК осуществляется полуконсервативным способом. Дополнительные сведения, подтверждающие названный способ, были получены в экспериментах с использованием ДНК-полимеразы (этот фермент катализирует полимеризацию дезоксинуклеозидтрифосфатов). ДНК-полимераза в виде очищенного энзима, выделенного из клеточных экстрактов Es heri hia oli, катализирует синтез ДНК в присутствии ионов магния, всех четырех нуклеотидов и ДНК-затравки [22,64]. [c.93]

В прямой зависимости от пирофосфатпой связи, то следовало бы ожидать, что расщепление АТФ с образованием орто- и пирофосфатов будет сопровождаться одинаковым изменением свободной энергии и что неорганический пирофосфат представляет собой макроэргическое соединение. Но стандартная свободная энергия гидролиза пирофосфата составляет только —3,8 ккал. Последствия термодинамических различий между отщеплением от АТФ орто- и пирофосфата особенно четко вырисовываются при сравнении синтеза синтетических полирибонуклеотидов и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Образование синтетических полирибонуклеотидов сопровождается отщеплением ортофосфата от нуклеозиддифос-фата эта реакция легко обратима. Синтез же ДНК сопровождается отщеплением пирофосфата от дезоксинуклеозидтрифосфата, и эта реакция обратима с трудом. [c.94]

Естественно было предположить, что дезоксинуклеозидтрифосфаты возникают либо путем непосредственного восстановления соответствующих рибонуклеозидполифосфатов, либо в результате метаболических превращений, параллельных описанным выше, по при этом протекающих с участием восстановленного сахарного компонента. Доказательство правильности пер- [c.469]

Субстратами реакции являются дезоксинуклеозидтрифосфаты дифосфаты не вступают в реакцию поликонденсации. Для реакции необходимы все четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (известны исключения) в отсутствие хотя бы одного из этих суб стратов образование полимера почти полностью прекращается. [c.509]

Синтез ДНК в бесклеточной системе впервые был осуществлен А. Корнбергом, удостоенным за эти работы Нобелевской премии в 1959 г. Для проведения синтеза необходимо пять существенных компонентов. Первый из них — фермент полимеразу — получали из культуры бактерий Е. oli с выходом 10 мг на 1 кг-культуры (такой выход составляет 20% от максимально возможного, так как на одну клетку приходится всего лишь около 100 молекул этого фермента). Кроме фермента необходимы аденозинтрифосфат (АТФ), являющийся источником энергии, Mg++, ДНК-затравка и монофосфаты всех четырех нуклеозидов, входящих в ДНК. После того как было показано, что под действием ферментов киназ дезоксинуклеозидмонофосфаты превращаются в соответствующие дезоксинуклеозидтрифосфаты, в экспериментах начали добавлять нуклеозидтрифосфаты. Именно по отношению к ним активна полимераза. Для синтеза существенны все четыре дезоксинуклеозида если присутствует лишь один из пред- [c.329]

В то время как в середине 50-х годов этого столетия для изучения репликации ДНК обычно использовались опыты по передаче метки родительской ДНК, Артур Корнберг и сотрудники попытались решить эту проблему, используя совершенно другие подходы. Корнберг предположил, что рост полинуклеотидных цепей-реплик должен катализироваться ферментом. Он предложил выделить этот фермент и изучить механизм его действия. С этой целью Корнберг получил из клеток Е. oli белковые экстракты и добавил эти экстракты к реакционной смеси, содержащей меченные или дезоксинуклеозидтрифосфаты типа [c.209]

Рис. 12-30. Схематизированное изображение радиоавтографа, демонстрирующего метаболическое сопряжение клеток, связанных щелевыми контактами, в культуре in vitro. Мутантные клетки лишены фермента тимидинкиназы и поэтому не могут включать в ДНК радиоактивный тимидин, добавленный в среду. Нормальные клетки способны включать тимидин в ДНК, и их ядра на радиоавтографе усеяны черными точками (зернами серебра). В смешанной культуре нормальных и мутантных клеток метку включают также ядра тех мутантных клеток, которые соприкасаются с нормальными клетками и образуют с ними щелевые контакты. Это обусловлено тем, что в нормальных клетках радиоактивный тимидин включается в низкомолекулярный предшественник ДНК (дезоксинуклеозидтрифосфат), который затем через щелевой контакт переходит в мутантную клетку и включается в ДНК.

В мозге млекопитающих обнаружены практически все ферменты, необходимые для эффективной репарации повреждений ДНК. Так, в мозге крыс и кроликов имеются основные ферменты, необходимые для синтеза дезоксинуклеозидтрифос-фатов, — рибонуклеотидредуктаза и тимидинкиназа. Активность этих ферментов особенно высока в мозге эмбрионов и новорожденных животных, у взрослых животных она сохраняется на довольно низком уровне, соответствующем невысоким потребностям в пополнении фондов дезоксинуклеозидтрифосфатов для [c.12]

Исходные растворы dNTP. Это четыре отдельных 50 мМ раствора каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов в воде. Хранить их следует небольшими аликвотами при —70 °С. Очень хороши для работы концентрированные растворы dNTP фирмы Pharma ia. [c.142]

Первый обнадеживающий результат на пути к пониманию ферментативного механизма репликации ДНК был получен А. Корнбергом (отцом) в 1956 г., когда он выделил из клеток бактерии Е. oli фермент ДНК-полимеразу. Этот фермент осуществлял синтез ДНК при наличии в реакционной смеси всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и молекул ДНК [c.126]

В такой реакции количество ДНК увеличивалось в 20 раз по сравнению с внесенным изначально. По своему нуклеотидному составу вновь синтезированная ДНК неотличима от исходной. Реакция полностью зависела от присутствия всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. Казалось бы, осуществлена репликация ДНК in vitro. Однако если в реакции А. Корнберга использовали трансформирующую ДНК, то ее трансформирующая активность в результате реакции не возрастала. Оказалось, что ДНК-поли-мераза не является истинной репликазой . Что же происходит в реакции Корнберга [c.126]

Продукт ORF В Ту-элемента отчасти гомоло-1ичен полипептидам, кодируемым ретровирусными генами pol (табл. 10.4). У ретровирусов эти гены кодируют несколько ферментов, в том числе про-теазу, эндонуклеазу, называемую также интегразой, и обратную транскриптазу (RT). Если в дрожжевых клетках Ту-элемент эффективно транскрибируется и транслируется, то в клеточных экстрактах обнаруживается активная обратная транскриптаза, а в частично очищенных фракциях таких экстрактов при добавлении дезоксинуклеозидтрифосфатов и синтезируется Ту-ДНК. Внесение мутации в ORF В приводит к утрате ферментативной активности, показывая еще раз, что обратная транскриптаза кодируется Ту-элементом. Клетки, в которых [c.252]

Б. Как будут модифиЩ1роваться эти концы, если инкубировать разрезанные молекулы ДНК с ДНК-полимеразой в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов [c.42]

Б. Как показано на рис. 5-58, концы, образующиеся при обработке BamHI, могут быть достроены ДНК-полимеразой, а концы, образующиеся при обработке PstI, - нет. Это различие объясняется известным свойством ДНК-полимеразы для ее работы необходимы праймер с З -ОН-концом, к которому могут присоединяться дезоксинуклеозидтрифосфаты, и матричная цепь, определяющая, какой нуклеотид должен присоединиться. Эти требования выпол- [c.307]

Смотреть страницы где упоминается термин Дезоксинуклеозидтрифосфаты: [c.414] [c.19] [c.424] [c.435] [c.606] [c.351] [c.379] [c.206] [c.199] [c.469] [c.211] [c.305] [c.209] [c.137] [c.168] [c.168] [c.198] [c.168] [c.168] [c.198] [c.304] [c.306] [c.23] [c.130] [c.339]

Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот (1990) -- [ c.8 , c.45 , c.46 ]

Молекулярная биология (1990) -- [ c.18 , c.45 , c.46 ]

Биоорганическая химия (1987) -- [ c.40 , c.148 , c.302 , c.352 , c.352 , c.407 ]

Основы биохимии (1999) -- [ c.248 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология