Фаг-помощник

Проведите перепроверку клонов, которые по предварительным данным дают комплементацию, на минимальных чашках М9. Отберите уколом бляшки с чашек LB и ресуспендируйте каждую в 100 мкл среды для разведения фага Выберите четыре фага (бесцветные бляшки) из полученных после отбора лизогенных бактерий и четыре фага из полученных после литического отбора. Рассейте штрихом все эти восемь фагов на одну минимальную чашку М9 с клетками His и с 2-10 частиц фага — помощника интеграции. Остаток используйте для получения препаратов фагов на чашках LB с агарозой. После инкубации в течение 6 ч при 37°С соберите с чашек урожай. Наливайте в чашку по 5 мл среды для разведения фага A и оставьте на ночь при 5°С. [c.45]

Смешайте 5-10 клеток с 2-10 частиц фага-помощника и 10 частиц гибридного фага. [c.105]

При таком соотношении клеток и фага большинство клеток будет заражено несколькими фагами-помощниками, но небольшая часть клеток будет заражена более чем одним гибридным фагом. Заметьте, что на чашки высевают по многу клеток. Если частота реверсий используемой мутации составляет 10 , то из колоний, выросших на минимальных чашках, несколько колоний окажется ревертантами. Эти ревертанты, наверное, содержат интегрированный фаг-помощник и могут содержать какой-то случайный гибрид фага К. Поэтому важно проводить повторный тест на комплементацию. [c.107]

Т-клетки фага-помощника, меченные анти-Ьеи-За [c.245]

Включение фрагментов генома хозяина в геном фага можно также продемонстрировать с помощью физико-химических методов, так как плотность фага Xdg отличается от плотности нормального фага. Это, по-видимому, объясняется следующими причинами. Замена области h в геноме фага на область gal бактериальной хромосомы может, вероятно, привести к тому, что длина фрагмента ДНК, отделяющегося в виде кольца от бактериальной хромосомы, будет отличаться от длины того фагового генома, который ранее включился в эту хромосому. В результате могут получаться дефектные трансдуцирующие фаги, содержащие либо больше, либо меньше ДНК, чем геном нормального фага Я. Ввиду того что количество белка в частице фага Я, очевидно, постоянно, а плотность его меньше, чем плотность фаговой ДНК, соотношение плотностей дефектного и нормального, инфекционного фага определяется соотношением количества входящей в их состав ДНК (фиг. 176). Благодаря такому различию в плотности удается осуществить физическое разделение смеси дефектных и нормальных частиц, а следовательно, и получение чистых препаратов фага Яс , освобвжденных от инфекционного фага-помощника. [c.351]

Напомним, однако, что если бы фага-помощника не было в клетке-хо-зяине, то дефектный геном не мог бы созреть в структурно законченную частицу фага.) [c.352]

Отсутствие фаговой ДНК в трансдуцирующих частицах фага Р1 позволяет объяснить сразу два факта, а именно что трансдуктанты, возникающие при единичном заражении нелизогенных реципиентов, нели-зогенны и что индукция лизогенных трансдуктантов, которые содержат профаг Р1, не приводит к образованию HFT-лизатов. Очевидно, что трансдуцирующие частицы фага Р1 содержат фрагменты бактериального генома, которые в отличи от бактериальных генов, входящих в состав Kdg, не рекомбинировали и не включились в состав какого-либо дефектного фагового генома. Поэтому эти фрагменты не наделяют реципиентную клетку иммунитетом против фага Р1 и не принимают участия в вегетативном размножении при наличии инфекционного генома фага-помощника Р1. [c.356]

Инфекционная ДНК фага Я обладает одной необъяснимой особенностью, которая заключается в том, что она способна инфицировать интактные клетки Е. oli в присутствии фага-помощника. С помощью генетических тестов можно отдифференцировать роль фага-помощника от роли самого фага X. В этом тесте только линейная форма ДНК обладает высокой инфекционностью и лишь при условии, что у этой ДНК и у ДНК фага-помощника имеются одинаковые липкие концы [95]. [c.174]

Так, например, если цепи ДНК разделить денатурированием, то ни одна из разошедшихся цепей инфекционностью обладать не будет (в системе с фагом-помощником). После ренатурации, однако, инфекционность восстанавливается 1951. Во время литической реакции ДНК фага находится преимущественно в суперспирализованной кольцевой форме, которая соответствует репликативной промежуточной форме ДНК этого фага. Кольцо разрывается только ко времени созревания вируса 1574]. [c.253]

В этот вектор также вставлен межгенный район однонитевого фага М13. При лизисе клеток, содержащих такую гибридную плазмиду (фазмиду), и суперинфицированных специальным фагом-помощником М13, образуются гибридные однонитевые ДНК в высоком титре (и в том числе клонированный ген), которые могут быть использованы для определения последовательности оснований. Преимущество такой конструкции перед фагом [c.153]

Если гены, клонированные в векторе %, экспрессируются в клетках Е. oli и могут комплементировать генетический дефект клетки-хозяина, то содержащие их фаги можно отобрать из всего пула гибридов. Такой тест на комплементацию можно проводить двумя основными способами. Первый из них заключается в том, что образуют лизогенную бактерию с гибридным фагом. После этого проверяют способность полученной лизогенной бактерии расти на селективных средах. Однако у многих векторов Х удалены гены, нужные для лизогенизации. В этом случае можно использовать фаг-помощник для образования двойных лизогенов. Второй метод отбора определенных гибридов фага Л заключается в литической комплементации. Обычно фаг Л неспособен размножаться в такой клетке, которая не может расти из-за какого-нибудь генетического дефекта. Однако если инфицирующий фаг вносит в клетку такой ген, который комплемен-тирует дефект клетки-хозяина, то клетка оказывается способной расти и поддерживать размножение этого фага. В конечном счете заразивщий фаг убьет клетку и образуется блящка. [c.42]

Приготовьте препарат с высоким титром пула гибридного фага на чашках, а также препарат фага — помощника интеграции (Хд14-/ас5). Препараты получайте на клетках, которые не могут расти на селективной минимальной среде (ВКК45). [c.105]

Фаг-помощник любой фаг att+ini+ с функциональной гомологической иммунностью, например фаг Xgt4-/a 5. [c.106]

Большинство используемых для клонирования векторов к не содержит функционально активного сайта прикрепления atir ) или функционально активного гена интеграции Ш+). Поэтому они не могут образовывать стабильных лизогенных бактерий. Можно, однако, использовать фаг-помощник, способный к интеграции. После его интеграции гибридный фаг к может встроиться уже в результате рекомбинации с гомологичными ему последовательностями. Такие двойные лизогены образуются с частотой около 1%. Излечивание от них происходит довольно легко, но их можно поддерживать с помощью селекции. [c.106]

Большинство фагов — помощников интеграции несет температурочувствительную мутацию по репрессору с1857. Поэтому температуру никогда нельзя поднимать выше 37°С. Использование мутации с1857 помогает выделять гибрид на этапе 10. [c.107]

Этапы 11 и 12) фаг — помощник интеграции несет область la и на чашках с Xgal образует голубые бляшки. Бесцветные бляшки образуют гибридные фаги, которые могли отвечать за рост клеток. [c.107]

Когда полная замена исходного белка оболочки на гибридный летальна для бактериофага, гибридный белок нарабатывают в бактериальных клетках под контролем фагмиды, а белок дикого типа обеспечивают заражением бактериальных клеток, содержащих фагмиду, фагом-помощником. В такой системе со- [c.335]

Б присутствии фага-помощника fl (или М13) фагмиды, используя сайт оп ), начинают реплицироваться как фаговые ДНК, образуя однонитевые копии плазмид, причем выбор нити для копирования зависит от ориентации оп-сайта. Образовавщиеся однонитевые ДНК могут упаковываться in vivo в капсулу и одновременно с фагом-помощником покидать естественным путем клетку. В препаратах однонитевых ДНК, выделенных из фагов, присутствует смесь ДНК фага-помощника и фагмид. Для больщинства задач (секвенирование приготовление зондов, мутагенез и т. п.) [c.216]

Клонирующие векторы созданы также на основе некоторых других фагов бацилл, не только умеренных, но и вирулентных. Как видим, векторная система клеток В. subtilis на основе ДНК фагов разработана относительно хорошо. Для малоизученных умеренных фагов бацилл предложен метод статистической интеграционной встройки чужеродных генов in vivo в соответствующий профаг. Индуцируя измененные в процессе такой интеграции профаги, получают гибридное фаговое потомство, которое в одних случаях может быть дефектным (размножается в присутствии фага-помощника), а в других — жизнеспособным. По-видимому, такой подход конструирования гибридных фагов применим и к малоизученным умеренным фагам Е. соН. [c.262]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология