ДНК выделение из космид

На самом деле, реальные векторы должны обладать еще целым рядом свойств в зависимости от целей их применения. Так, очень важно, чтобы вектор позволял осуществлять вставку чужеродной ДНК различной молекулярной массы и чтобы свойства вектора давали возможность различать клоны бактерий, несущих исходные векторные и рекомбинантные молекулы. Удобно работать с небольшими по размеру векторами, которые к тому же дают большое число копий на клетку, что облегчает выделение и очистку векторной и рекомбинантной ДНК. Векторная молекула должна иметь как можно больше единичных последовательностей, узнаваемых различными рестриктазами, что может обеспечиваться введением полилинкеров. Лучше всего разработана система вектор — хозяин для бактерий Е. соИ. В этом случае используется четыре типа векторов 1) плазмиды 2) бактериофаг Я. 3) производные бактериофага Я, (космиды и фазмиды) [c.143]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

Были сконструированы специальные векторы, в которых содержались промоторы для РНК-полимераз фагов 5Р6, Т7 пли ТЗ, расположенные в непосредственной близости от сайтов клонирования распространенных фаговых и космидных векторов. Наличие таких промоторов делает возможным быстрый синтез радиоактивных РНК-зондов, специфичных по отношению к концам клонированного фрагмента ДНК полученные зонды представляют собой идеальный инструмент для прогулки по геному . Это общий метод выделения фрагментов ДНК, располагающихся в геноме по соседству с уже клонированным в составе соответствующего вектора участком ДНК. Постановка таких экспериментов с использованием космид описана в работе [26] и гл. 2 этой книги. [c.37]

Основное достоинство генетического подхода — быстрота и эффективность метода достаточно большое число экспериментов можно проводить параллельно. Поэтому не возникает нужды в повторном скрининге, что делает этот метод особенно удобным там, где требуется повторное выделение многих космид (например, при прогулке по хромосоме ). Другое преимущество генетического метода — очень высокая чувствительность гомологичной рекомбинации к ошибочному спариванию последовательностей [25, 26], Данное обстоятельство может быть особенно удобным, например, при выделении космид, содержащих конкретные копии тех или иных семейств генов, или в экспериментах по прогулке по хромосоме . Такие эксперименты упрощаются при работе с некоторыми из наших новых векторов (Эрих и др., в печати), содержащих ЫоИ-сашы, фланкирующие инсерционный сайт, что позволяет провести быстрое и избирательное клонирование концевых фрагментов вставки в производных риС18 или рЕМВЬ18, содержащих 7Уо/1-сайты в полилинкере. [c.84]

Существует много способов выделения плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Приводимая нами методика проста и вполне воспроизводима, но ее почти всегда можно заменить на другую. Мы описываем процедуру наработки космид Лориста — производных фага Я. Для других космидных векторов при необходимости можно ввести небольшие модификации. [c.60]

Размножайте клетки в L-среде с 30 мкг/мл канамицин-суль-фата. Никогда не выращивайте космидсодержащие клетки без антибиотика и всегда — с хорощей аэрацией. Для получения-мини-препаратов мы выращиваем 5 мл в 50-миллилитровой пробирке, для препаративного выделения — 500—1000 мл в колбе на 2 л с энергичной аэрацией. Засев произведите введением-одной колонии или небольшого количества стационарной культуры и инкубируйте в течение ночи (17 ч) при 37 °С. Некоторые космиды обусловливают плохой рост клеток в таких случаях культура не достигает стационарной фазы и ее нужно культивировать дольше. Для космид, не являющихся производными фага К, мы не рекомендуем проводить амплификацию в присутствии хлорамфеникола. Это может повысить выход, но может также привести к преимущественной репликации делеционных производных исходных рекомбинантов. [c.60]

Данный метод может быть также распространен на анализ космид, упакованных in vivo в хелперных клетках, т. е. фосмид, описанных в разд. 2,2.8.5. Детальное описание этой методики можно найти у Литтла и Кросса [6]. Проблема выделения фос- [c.64]

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

Настоящая глава посвящена генетическим подходам к выделению, генноинженерному манипулированию и анализу индивидуальных космидных клонов или библиотек клонов. В ней представлены методики упаковки космидных клонов в лямбо-доидные фаговые частицы и отбора нужных космид (или плазмид) из полных библиотек путем гомологичной рекомбинации. Рассмотрены также способы модификации отобранных клонов или групп клонов с помощью вставок или замещений определенных последовательностей. [c.74]

Представляется возможность не только отбирать специфические космидные клоны из космидных библиотек, но и использовать специфические космиды для выделения клонов из сложных плазмидных библиотек. Этот подход можно использовать и для выделения клонов кДНК, содержащих последовательности, кодируемые вставочным фрагментом данного космидного клона. [c.84]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология