Отрицательная МНС-рестрикция

Технология выделения и экспрессии чужеродных генов в Е. соН и в некоторых других микроорганизмах достаточно хорошо отработана, однако не стоит забывать, что синтез гетерологичного белка в организме-хозяине может оказывать на него негативное влияние. Например, сверхпродукция такого белка может привести к истощению метаболических ресурсов хозяйского организма и отрицательно повлиять на его рост. Присутствие гетерологичного белка может оказаться даже губительным для клетки-хозяина. Так, сайты рестрикции имеются во всех молекулах ДНК, и если продуктом клонированного гена является эндонуклеаза рестрикции, то в отсутствие специальных защитных механизмов хозяйская ДНК будет расщепляться ею. [c.247]

Использование рационального редизайна полипептидных цепей рестриктаз E oRl и E oRV с целью изменения их субстратной специфичности пока не завершилось успехом [320]. Замены аминокислотных остатков, вовлеченных в процесс распознавания субстрата, неизменно сопровождались снижением специфичности фермента и уменьшением его удельной активности. Предполагается, что сложная сеть ДНК-белковых взаимодействий при взаимодействии рестриктазы с ДНК формируется кооперативно, и любые вмешательства в эту сеть приводят к отрицательным последствиям. В настоящее время остаются в значительной степени непонятными энергетические характеристики динамических структур, формирующихся в комплексах фермент-ДНК, а также, что еще более важно, нет возможности количественной оценки влияния каждого контакта в таких комплексах на все другие контакты, то есть на кооперативность взаимодействий. Кроме того, на сегодняшний день отсутствует понимание структурных и термодинамических особенностей, а также функциональной роли альтернативных конформаций ферментов, которые он принимает в комплексах с частично измененными сайтами рестрикции и которые не может расщеплять. Однако без таких знаний трудно рационально воздействовать на специфичность действия рестриктазы. [c.443]

Несмотря на то, что многие детали процесса обучения лимфоцитов в тимусе пока еще не известны, в целом ясны по меньшей мере следующие закономерности. Биохимические преобразования в лимфоцитах индуцируют растворимые факторы, которые вырабатываются эпителиальными клетками тимуса. Процессы положительной и отрицательной селекции, а также рестрикция по МНС критически зависят от контактных взаимодействий тимического лимфоцита с разными клетками стромы этого органа. Важнейшим условием нормального созревания и обучения является строго детерминированная миграция лимфоцитов из одного отсека тимуса в другой, а затем — в третий. [c.125]

Аффинность растворимого ТкР к комплексам из различных пептидов и соответствующих элементов рестрикции (антигены МНС) можно определить биофизическими методами, например методом поверхностного плазмонного резонанса. Существует прямая корреляция между временем полужизни ТкР-связи с комплексом молекула МНС-пептид и реакцией зрелых Т-клеток, экспрессирующих тот же рецептор (т. е. агонист > антагонист > посторонний пептид). Однако в органной культуре тимуса добавление пептида-агониста вызывает делецию развивающихся клеток (отрицательная селекция), тогда как пептид-антагонист стимулирует положительную селекцию. Это показывает, что низкоавидное взаимодействие стимулирует положительную селекцию, а высокоавидное - отрицательную. [c.263]

Обе эти экспериментальные модели были использованы для изучения роли стромальных клеток тимуса в процессе обучения , включающего отрицательную селекцию (формирование толерантности Т-клеток к аутоантигенам) и положительную селекцию (рестрикция по специфическим антигенам МНС, с которыми преимущественно взаимодействуют хелперные и эффекторные популяции Т-клеток). Результаты таких экспериментов, проведенные на Xenopus, свидетельствуют об участии эпителия чужеродного тимуса в положительной селекции и индукции толерантности к кожным трансплантатам с МНС-специ-фичностью тимуса, хотя, что удивительно, эта толерантность не препятствует возникновению реакции смещанной культуры лимфоцитов на клетки донора тимуса. Аналогичные данные получены на зародыщах птиц и млекопитающих. [c.302]

Как можно судить по немногочисленным данным относительно изоэлектрнческой точки эндонуклеаз рестрикции (см. табл. 19), рестриктазы являются слабокислыми белками (значения р1 находятся в области 4,6—6,3). Этот факт, на первый взгляд, вызывает некоторое изумление, так как наличие отрицательного заряда на белковой глобуле должно препятствовать образованию комплекса с отрицательно заряженной молекулой ДНК, однако, не следует забывать, что изоэлектрическая точка отражает электростатическое состояние всей белковой глобулы и поэтому не исключает существования положительно заряженных участков. [c.68]

Неудача клонирования может быть связана и с отсутствием экспрессии клонированных генов rm. Гены рестрикции— модификации выявлены в самых различных таксонах (см. разд. 2, часть I). Клонирование их осуществляется практически исключительно в кишечную палочку. Имеющиеся сведения свидетельствуют, что в Е. oli удается клонировать гены rm из представителей таксонов генетически довольно отдаленных от кишечной палочки. Однако, вопрос о том все ли эти гены экспрессируются с собственных промоторов пока до конца де исследован. Методическое решение проблемы экспрессии видится в реализации нескольких подходов. В первую очередь следует обратить внимание на то, что большое число рестриктаз выявлено в штаммах, относящихся к семейству Enteroba teria-сеа (см. гл. 2, часть I) в которое входит и Е. oli. Учитывая большое генетическое родство между представителями энтеробактерий, следует предположить и меньшую вероятность получения отрицательных результатов по клонированию в кишечную палочку за счет барьера гетерологической экспрессии. [c.189]

Экспфименты с трансплантацией тимуса позволяют предполагать, что положительная селекция, с помощью которой объясняют рестрикцию МНС, и отрицательная селекция, придающая толерантность к собственным МНС, - это два независимых процесса. Положительная селекция происходит, видимо, на поверхности собственных эпителиаль- [c.279]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология