Получение в организме хозяина

Молекулярная биотехнология — это увлекательнейшая область научных исследований, с появлением которой произошел настоящий переворот во взаимоотношениях человека с живой природой. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой, осуш ествляемый методами генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах. В ч. I мы познакомим читателя с концепциями молекулярной биотехнологии и теми микроорганизмами, которые в ней используются, с основами молекулярной биологии и методологией рекомбинантных ДНК. Будут описаны такие методы, как химический синтез генов, полимеразная цепная реакция (ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Помимо успешного клонирования нужного гена очень важно обеспечить его правильное функционирование в организме нового хозяина, поэтому мы остановимся также на способах оптимизации работы клонированных генов в про- и эукариотических системах. И наконец, мы рассмотрим, как можно улучшить свойства конечных продуктов, модифицируя клонированные гены путем введения в них специфических нуклеотидных замен (мутагенез in vitro). В целом материал, изложенный в первой части, служит фундаментом, который позволяет понять различные аспекты конкретных применений молекулярной биотехнологии. [c.13]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Следующий этап генетической инженерии—перенос генов в клетку — осуществляется тремя способами трансформацией (перенос генов посредством выделенной из клеток и освобожденной от примесей ДНК), трансдукцией (перенос генов посредством вирусов) и гибридизацией клеток, полученных из разных организмов (высших животных, микроорганизмов и др.) (рис. 13.7, 13.8). Заключительный этап этих экспериментов сводится к адаптации введенного гена в организме хозяина, но он почти не зависит от искусства экспериментатора. [c.496]

Получение методом генетической инженерии химерных антител, содержащих F -фрагмент антител человека, связанный с Р(аЬ) 2-фрагментом антител мыши, позволяет снизить вероятность иммунного ответа на мАт со стороны организма-хозяина. Кроме того, F -фрагмент антител человека обеспечивает мобилизацию эффекторных механизмов хозяина. Другой путь оптимизации терапевтического действия мАт -связывание с ними различных молекул для нацеливания на опухолевые клетки. К таким молекулам относятся. например, токсины (2), цитотоксические лекарственные препараты, ферменты, способные активировать пролекарства (3) или радиоактивно меченные изотопы (4). (мАт - моноклональные антитела.) [c.389]

Системы экспрессии весьма разнообразны, и исследователям приходится каждый раз подбирать условия, наиболее подходящие для получения того или иного белка в том или ином организме-хозяине. И все же, несмотря на различия в деталях, для создания самых разных систем экспрессии используются одни и те же основные приемы. [c.131]

Микоплазмы (особенно после обнаружения новых свободно-живущих видов) представляют собой группу, чрезвычайно разнообразную с точки зрения физиолого-биохимических особенностей. Эти прокариоты могут расти на искусственных средах разной степени сложности (от простых минеральных сред до сложных органических) или только внутри организма-хозяина, из чего можно заключить, что диапазон их биосинтетических способностей весьма широк. Разнообразны и способы получения микоплазмами энергии. Среди них описаны виды, получающие энергию [c.170]

ПОЛУЧЕНИЕ В ОРГАНИЗМЕ ХОЗЯИНА [c.150]

Микоплазмы (особенно после обнаружения новых свободноживущих видов) представляют собой группу, чрезвычайно разнообразную с точки зрения физиолого-биохимических особенностей. Эти прокариоты могут расти на искусственных средах разной степени сложности (от простых минеральных сред до сложных органических) или только внутри организма-хозяина, из чего можно заключить, что диапазон их биосинтетических способностей весьма широк. Разнообразны и способы получения микоплазмами энергии. Среди них описаны виды, получающие энергию за счет окисления или сбраживания органических соединений (моно- и полисахаридов), а также, возможно, окисления неорганических соединений (железа, марганца). Описаны микоплазмы, являющиеся строгими аэробами и облигатными анаэробами, а также виды, растущие только в условиях высокой кислотности среды (ацидофилы) и повышенной температуры (термофилы). [c.158]

Все это заставило ученых исследовать возможность получения гетерологичных белков с помощью других видов дрожжей и с использованием эукариотических систем. В частности, изучались соответствуюшие векторы — системы экспрессии, содержащие видоспецифичные регуляторные последовательности транскрипции и трансляции, возможность трансформации этих видов и получения высокого выхода белков и возможность крупномасштабного культивирования организма-хозяина. В качестве альтернативы S. erevisiae можно использовать Kluyveromy es la tis, дрожжи, которые применяют для промышленного производства лактозы [c.140]

Клонирование генов (Gene loning) Система методов, использующаяся для получения клонированных ДНК вьщеление нужного гена из какого-либо организма, встраивание его в плазмиду (вектор), введение в клетку организма-хозяина, многократная репликация. [c.550]

Келлог с сотр. использовали процесс, который они назвали молекулярная селекция, связанная с плазмидой [698]. Образцы из нескольких свалок отходов были смешаны с набором бактериальных штаммов, полученных в других исследованиях и содержащих ряд катаболических плазмид. Культивирование проводилось в хемостате при постепенном повышении концентрации 2,4,5-Т в течение 8—10 мес. В конце этого периода были выделены организмы, способные к разложению 2,4,5-Т. Авторы полагают, что присутствие различных катаболических плазмид вызывает, хотя и при неспецифическом взаимодействии, образование этого штамма, отсюда и молекулярная селекция, связанная с плазмидой . Можно, однако, отметить, что избранная методика не исключает возможности более прямого селективного обогащения одного или более микроорганизмов, существующих на свалках отходов. Одним из организмов, выделенных по этой методике, является штамм Pseudomonas epa ia A 1100. Этот организм может использовать 2,4,5-Т или 2,4,5-трихлорфе-нол как единственный источник углерода и энергии [699]. Этот штамм содержит две плазмиды, но пока не доказано их участие в деградативной способности организма-хозяина [700], точная роль плазмид в разложении 2,4,5-Т не определена. [c.334]

Развитие болезни в хозяине. После того, как бактерия проникла в тело насекомого в виде вегетативной клетки (из кишечника или путем инъекции) или в виде споры (путем инъекции), происходит развитие возбудителя в гемолимфе. Ткани тела остаются непораженными, фагоцитоза также нет. Датки наблюдал развитие возбудителя в жировом теле на стенках кишечника. Гибель хозяина вызывается, по-видимому, вредным влиянием метаболитов, образующихся при развитии бактерий, и поглощением ими большей части питательных веществ. Болезнь сопровождается поносами, иногда выделением темных экскрементов, что служит признаком нарушения функций кишечника, необычно сильного размножения обычной микрофлоры и, вероятно, также проникновением гемолимфы в кишечник через разрушенный эпителий. Болезнь неодинаково проявляется в разных органах, и точно установить момент гибели больной особи при продолжительном течении болезни невозможно. Гибель хозяина не связана с какой-либо определенной фазой развития бактерии, а также с изменением pH гемолимфы или с различиями в окислительно-восстановитель-ном потенциале. Организм хозяина не реагирует на заражение как на патологический процесс и не защищается от инфекции иммунными реакциями. Болезнь увеличивает время прохождения отдельных стадий развития насекомых и препятствует метаморфозу. Берд [19] исследовал возможные влияния токсинов на гемолимфу, но полученные им результаты не позволили сделать каких-либо выводов. [c.226]

Ни на одной из до сих пор испытанных сред возбудитель не продуцирует вирулентных спор, поэтому его необходимо размножать только в организме хозяина. С этой целью В. popilliae вводят в организм личинки путем инъекции (рис. 36). Выход патогена составляет около 10 спор на личинку. Погибших от бактериоза личинок измельчают, и полученный сырой препарат смешивают с наполнителем. Дусты на этой основе под названием дум ( Doom ) находятся в продаже в США. Их активность сохраняется в течение многих лет. Обработку этими препаратами осуществляют в основном путем введения в почву, зараженную личинками жука. Наполненные спорами трупы погибших от бактериоза личинок разлагаются, и почва постепенно становится подлинным резерватором спор. Кроме того, бациллы медленно, но непрерывно распространяются в популяциях личинок, заселяющих обработанный район. Таким путем в восточных штатах США японский жук постепенно утратил свое значение на больших пространствах [270]. [c.175]

Принципиально новый шаг в решении этой проблемы был сделан после того, как был предложен способ получения моноклональных антител (Г. Кёлер, К. Мильштейн, 1975) (рис. 17). В ответ на введение антигена в организме мыши активируются продуцирующие антитела В-клетки. Эти клетки могут жить только в организме хозяина и при их переводе в искусственную культуральную среду быстро гибнут. Однако если слить иммунную клетку с опухолевой (миеломные лимфоциты, которые способны неограниченно долго жить в искусственной среде), то в результате образуются гибридные клетки, унаследовавшие свойства своих предшественников, так как они способны долго жить в искусственных условиях и одновременно синтезировать антитела. Такие клетки получили название гибридом . С помощью специальных методов на особых ростовых средах можно отобрать отдельные клетки, синтезирующие только один тип антител. Такие клетки помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных ( клон ), синтезирующих большое количество антител, получивших название моноклональных. Моноклональные антитела — это антитела, однородные по своей структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах. [c.105]

Оценка вирулентпости мутантов свидетельствует о сложности этого свойства и тонкой подгонке обменных процессов паразита к таковым у хозяина. Абсолютное большинство изменений в организме паразита, происходящих в результате различных мутаций, приводит к неспособности вызывать заболевание растения-хозяина. Аналогичная ситуация должна возникать и при изменениях в организме растения-хозяина, что может обусловить успешное применение индуцированного мутагенеза в получении устойчивых к вилту форм хлопчатника. Для выделения у патогена мутантов но вирулентности, способных поражать более широкий или иной круг сортов растения-хозяина, необходимо, по-видимому, изучение прежде всего форм, слабоотличающихся от дикого типа по другим признакам. [c.337]

Таким образом, оценка смертности в те периоды, когда она наблюдается, требует введения понятия о компенсационной или распределительной смертности. Это понятие вытекает из теории зависимости от плотности (см. выще зазбор точек зрения Томпсона [2052] и Морриса 1415]). Плотность, при которой популяция регулируется данным естественным врагом, является характерной для данных условий местности, температуры, свойств организма и т. п. Так как в действии естественного врага часто наблюдается заметная эластичность и повышение его эффективности связано с увеличением плотности популяции хозяина, отсутствие смертности в какой-то момент в период роста популяции хозяина часто обеспечивает болыиук смертность, обусловливаемую этим же 1ПИ каким-либо другим естественным врагом , последующее время. Отсюда смертность, вызвгктая каким-либо не зависящим от плотности действием, в ранний период будет лишь компенсационной или выравнивающей для конечного результата, т. е. в той степени, что она мож(ч быть заменена действием естественного врага в любом случае [617]. Именно поэтому мы считаем, что значение фактических учетов смертности не обязательно соизмеримо с размерностью полученных данных, и именно поэтому мы подчеркиваем необходимость использования для анализа метода контроля, когда это возможно (см. главу 14). [c.87]

Вследствие различия в механизмах экспрессии генов у прокариот и эукариот, Е. oli может оказаться хозяином, мало подходящим для производства белков эукариотических организмов. Поэтому разработаны методы получения векторов для клонирования различных генов в клетках дрожжей - одноклеточных эукариот. Эти клонирующие векторы получают из репликонов дрожжевых клеток, так называемых 2 л-плазмид. Точки начала репликации этих векторов взяты у плазмид 2 л и у pBR322, в результате чего они могут реплицироваться как в дрожжевых клетках, так и в . соИ. Примером использования дрожжей для синтеза белков посредством клонирования генов эукариот может служить осуществленный таким образом синтез интерферона человека (интерферон-белок, обладающий противовирусным действием в клетках человека и, возможно, противоопухолевым действием вообще). [c.290]

Основой для манипуляций с оплодотворенными и неоплодотворенными яйцеклетками млекопитающих послужило развитие техники получения до-имлантационных зародышей, культивирования их в синтетических средах in vitro, последующего переноса приемной матери и рождения организма. В это же время появились методические приемы разделения зародыша на части или, напротив, слияния нескольких зародышей для получения так называемых химер (Мак-Ларен, 1979). В экспериментах Лина с помощью микрохирургической техники было показано, что инъекция растворов определенных объемов в цитоплазму или отсасывание части цитоплазмы из оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) мыши не сказывается на нормальном развитии зародышей и не препятствует рождению здорового потомства (Lin. 1967). В середине 70-х годов были опубликованы первые работы по инъекции ДНК вирусов в полость бластоцисты мышей (Jaenis h, 1974, 1976), в которых была доказана способность чужеродной вирусной ДНК интегрировать с геномом хозяина и затем передаваться по наследству. И, наконец, [c.185]

У многих вирусов генетическая информация также закодирована в ДНК. Механизмы репликации, репарации, перестройки и экспрессии вирусной ДНК аналогичны механизмам, используемым клетками других организмов. Геном некоторых вирусов представлен не ДНК, а РНК. Геномная РНК таких вирусов либо непосредственно транслируется в белки, либо обладает генетической информацией, необходимой для синтеза молекул РНК, которые Б свою очередь транслируются в белки. Те вирусы, у которых геном представлен РНК в течение всего жизненного цикла, должны сами реплицировать родительскую РНК для получения потомства вирусных частиц. Существует класс ретровирусов, репродуктивный цикл которых начинается с того, что их генетическая информация в ходе так называемой обратной транскринции переводится на язык ДНК. Полученные копии ДНК, или провирусы, способны к регшикации и экспрессии только после интеграции в хромосомную ДНК клетки. В такой интефированной форме вирусные геномы реплицируются вместе с ДНК клетки-хозяина, и для образования нового поколения вирусных геномов и мРНК, нужной для синтеза вирусных белков, они используют транскрипционный аппарат клетки. [c.38]

Системы с другими хозяином и вектором едва ли когда-нибудь смогут конкурировать с Е. со//-систе-мами В том, что касается вьщеления и очистки сегментов ДНК. Тем не менее возможность эффективного клонирования в других видах бактерий очень важна для изучения генетических свойств и экспрессии генов у организмов, представляющих научный, медицинский или промышленный интерес. Поэтому, несмотря на малое число хорошо охарактеризованных плазмид и бактериофагов и экспериментальные трудности при введении молекул ДНК в некоторые клетки, были разработаны полезные системы, способные служить векторами. Если отсутствовали подходяш ие для данного вида природные плазмиды или фаги, то иногда использовали плазмиды и фаги, полученные от других бактерий. Многие плазмиды и бактериофаги весьма требовательны и реплицируются только в одном или нескольких родственных видах клеток, но некоторые из них на удивление неприхотливы и репродуцируются в широком Круге хозяев, принадле-жагцих К разным видам. [c.249]

Streptomy es. Представители грамположитель-ных организмов рода Streptomy es кодируют большинство известных применяемых в медицине антибиотиков. Поэтому получение удобных систем хозяин-вектор для Streptomy es очень важно как для изучения биосинтеза антибиотиков, так и для создания новых антибиотиков и повышения эффективности продуцентов. Наиболее разработанные в на- [c.249]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология