Бесклеточные системы трансляции

Получение бесклеточной системы трансляции из ретикулоцитов кролика, обработанной микрококковой нуклеазой [c.221]

Хорошим примером полицистронной мРНК является РНК малого РНК-содержащего бактериального вируса (фага) MS2. Фаг MS2 — сферический он имеет диаметр 2,5 нм и молекулярную массу 3,6 10 дальтон. Фаг построен из 180 субъединиц белка оболочки с молекулярной массой 14700 дальтон каждая, одной молекулы так называемого А-белка с молекулярной массой 38000 дальтон и одной молекулы РНК с молекулярной массой 10 дальтон. После попадания фага в клетку Е. соИ (а также в бесклеточной системе трансляции) эта РНК служит матрицей для белка оболочки, А-белка и субъединицы РНК-репликазы с молекулярной массой 62000 дальтон, которая в состав фага не входит. Схема расположения соответствующих цистронов вдоль цепи этой мРНК дана на рис. 6. Цепь начинается с G, имеющего трифосфат на своем 5 -гидроксиле. Далее следует длинная некодирующая нуклеотидная последовательность. Общая длина 5 -концевой некодирующей последовательности 129 остатков в ней встречаются триплеты AUG и GUG, которые, однако, не являются инициаторными. Первый инициаторный кодон, GUG, начинает кодирующую последовательность А-белка (А-цистрон). А-цистрон имеет длину 1179 остатков и заканчивается терминаторным кодоном UAG. Затем идет некодирующая вставка длиной 26 остатков. Следующая кодирующая последовательность начинается с AUG и имеет длину 390 остатков это —цистрон белка оболочки (С-цистрон). Он оканчивается терминаторным кодоном UAA, и за ним непосредственно следует второй терминаторный кодон UAG. Последовательность длиной 36 остатков отделяет С-цистрон от S-цистрона, кодирующего субъединицу РНК-синте-тазы. S-цистрон начинается с AUG, имеет длину 1635 остатков и заканчивается UAG. За ним через один остаток (т. е. не в фазе) имеется еще один терминаторный триплет UGA. З -концевая некодирующая последовательность имеет общую длину 174 остатка и заканчивается аденозином со свободной г/мс-гликольной группиров- [c.20]

Рибосома имеет собственное сродство к матричным полинуклеотидшу / Уже давно известно, что среди синтетических полирибонуклеотидов вакантная рибосома лучше всего связьшает полиуридиловую кислоту, на чем и было основано широкое применение поли(и) в качестве матрицы в бесклеточных системах трансляции. Возможно, что отсутствие стабильной вторичной и третичной структуры в поли(и) является существенным фактором ее хорошего связьшания с рибосомой. В случае природных мРНК имеются совершенно определенные предпочтительные места на полинуклеотиде, с которыми могут связьшаться вакантные рибосомы (см. гл. В.VI). В любом случае прочная сплошная двойная спираль вряд ли может служить местом присоединение вакантных рибосом. [c.136]

Простой прием, обеспечивающий возможность трансляции плюс-нити днРНК, не транслируемой в обычных условиях,— это денатурация ее при низкой температуре в 90%-ном ДМСО. Согласно основной методике, осадок днРНК ресуспендируют в воде до концентрации около 20 мг/мл, затем добавляют ДМСО до концентрации 90%. Важно добиться полного растворения РНК перед внесением ДМСО, а ДМСО добавлять постепенно, тщательно перемешивая раствор на каждом этапе. После добавления всего ДМСО смесь прогревают 20 мин при 45°С для полной денатурации и добавляют к бесклеточной системе трансляции. Если использовать указанную выше концентрацию РНК, то внесение 2,5 мкл в бесклеточную систему объемом 100 мкл обеспечивает ее насыщение мРНК и в то же время достаточно низкую концентрацию ДМСО, не оказывающую ингибирующего действия на синтез белка [20]. [c.217]

Для получения полупроницаемых мембран клетки животных выращивают в культуре и обрабатывают детергентом дигитони-ном, повреждающим внешнюю мембрану в мягких условиях, что, в конечном счете, позволяет выделять клетки, свободные от компонентов цитозоля, но сохраняющие основные черты своей внутренней архитектуры. В последующих опытах SP-клетки можно добавлять в бесклеточные системы трансляции мРНК (см. ниже) и наблюдать за прохождением синтезирующегося белка через внутриклеточные компартменты. Для получения SP-клеток могут быть использованы любые клеточные линии, однако, каждая из них для достижения наилучших результатов требует проведения специальных этапов оптимизации. С использованием SP-клеток так же, как и бесклеточных систем, можно легко исследовать влияние отдельных компонентов на прохождение всего моделируемого внутриклеточного процесса в условиях, максимально приближенных к нативным. Кроме того, добавление к SP-клеткам реагентов, осуществляющих поперечные сшивки, позволяет фиксировать синтезирующиеся белки в просветах эндоплазматического ретикулума, что дает новые возможности для локализации систем фолдинга и внутриклеточного транспорта белков. Поскольку получение SP-клеток допускает использование любых клеточных линий, в том числе и мутантных, с их помощью можно исследовать роль генетических факторов во всех вышеупомянутых процессах. [c.184]

Несмотря на мощный прогресс, бесклеточные системы трансляции годятся только для а 1алитических работ для препаративно о синтеза они непригодны по причине слишком мало- [c.12]

Количество каждого из синтезируемых белков зависит от нескольких факторов. Во-первых, как мы отмечали, скорости транскрипции разных сегментов дцРНК существенно различаются [132]. Это приводит к различиям в относительных количествах разных классов мРНК и в свою очередь — к различиям в количествах вирусных белков [158, 352]. Во-вторых, эффективность трансляции разных мРНК неодинакова 132] это касается как зараженных клеток, так и бесклеточной системы трансляции [28, 108, 109, 167, 187, 188, 278, 281, 352, 353]. [c.290]

Еще один важнейший аспект получения белков для практических целей был обозначен акад. А. С. Спириным в докладе на юбилейной сессии Академии наук СССР (март 1987 г.). Он сводится к преодолению клеточного уровня биосинтеза белков и переходу к масштабированному их синтезу в бесклеточных системах трансляции непрерывного действия, работающих в проточном режиме. Это откроет возможность получать биологически значимые белки (интерферон, инсулин, ах-антитрипсин) и пептиды медицинского назначения, позволит конструировать и производить белки с любыми заданными свойствами, поднимет на новый уровень изучение закономерностей химической коэволюции белков и нуклеиновых кислот. Решающую роль здесь играет наработка необходимых количеств соответствующих мРНК в системах, содержащих РНК-зависимую РНК-полимеразу типа репликазы фага Qp. Уже создана и опробована на РНК-4 вируса мозаики костра, РНК фага М82 и мРНК кальцитонина установка для твердофазной трансляции типа реактора непрерывного действия. Указанные работы по внеклеточному синтезу белка ведутся в рамках Государственной научно-технической программы Новейшие методы биоинженерии . Уже сегодня в лабораторных условиях на небольших биореакторах этим методом можно получать достаточное для дальнейших исследований количество пептидных гормонов, антигенов для диагностических целей, белковых токсинов и антитоксинов, антивирусных защитных белков, некоторых ферментов. Революция в молекулярной биологии и биотехнологии продолжается. [c.305]

Рис, 14.7. Влияние добавки экзогенного эукариотического фактора инициации 2 к бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика. Добавленный эФИ2 увеличива.т син1ез белка ло уровня, близкою к наблюдаемому в системе, стимулированной гемином. (По lemens ei al,, 1974.) [c.203]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология