Связывание аффинного лиганда с сефарозой, активированной бромцианом

СВЯЗЫВАНИЕ АФФИННОГО ЛИГАНДА С СЕФАРОЗОЙ, АКТИВИРОВАННОЙ БРОМЦИАНОМ [c.16]

Изучение влияния концентрации е-амино-капроновой кислоты на ее связывание активированной бромцианом сефарозой показало, что высокая концентрация аффинного лиганда при коротком времени инкубации дает лучшие результаты, чем низкая концентрация при продолжительной инкубации. [c.192]

Отмытую И декантированную сефарозу суспендируют в дистиллированной воде (1 1). Работу ведут под тягой. В суспензию сефарозы погружают электроды рН-метра и при постоянном перемешивании прибавляют к ней небольшими порциями бромциан (50—300 мг на 1 мл набухшей сефарозы). Добавляя раствор гидроксида натрия, pH суспензии поддерживают примерно около И. Для 5—10 мл сефарозы и 1—3 г бромциана рекомендуется 2М раствор гидроксида натрия, для 100—200 мл сефарозы и 20—30 г бромциана — 8М его раствор. Температура должна быть равна примерно 20 °С если необходимо охлаждение, добавляют лед. Реакция заканчивается через 8—12 мин. Далее Куатреказас рекомендует добавить большое количества льда и быстро перенести суспензию в воронку Бюхнера. Активированную сефарозу промывают при постоянном отсасывани предварительно охлажденным буферным раствором того же состава, который используют при последующем связывании аффинного лиганда. Объем буферного раствора, расходуемый на промывку сефарозы, должен в 10—15 раз превышать объем раствора, в котором проводилась активация сефарозы. Промытую сефарозу как можно быстрее суспендируют в равном объеме раствора аффинного лиганда. Связывание ведут при постоянном перемешивании при пониженной температуре (4°С) в течение 16—20 ч. Согласно данным Куатреказаса [14], промывка, добавление раствора аффинного лиганда и смешивание не должны длиться более 90 с. Даже при пониженной температуре активированная сефароза неустойчива. Связывание аффинного лиганда с активированной бромцианом сефарозой более подробно рассматривается в лоследующих разделах. [c.17]

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрвдей лиганд присоединяют к носителю через промежуточное звено (вставку, ножку, спейсер). Присоединение лигандов к поперечносшитой агарозе — сефарозе обычно проводят, активируя ее бромцианом (см. с. 91). Связывание с сефарозой, активированной бромцианом, л-амино-бензилянтарной кислотой, используемой в качестве лиганда, обеспечивает взаимодействие сорбента с каталитическим центром только карбоксипептидаз благодаря сходству лиганда с субстратами карбоксипептидазы [c.82]

Когда связывание аффинного лиганда на нерастворимом носителе закончено, рекомендуется удалить остающиеся активные группы, чтобы исключить дальнейшее связывание. Если аффинный лиганд связывается своими аминогруппами, в качестве инактивирующих агентов наиболее часто используются низкомолекулярные первичные амины. Например, согласно рекомендациям фирмы РЬагтас1а, при связывании на сефарозе, активированной бромцианом, инактивация остающихся активных групп может быть достигнута достаточно просто при взаимодействии с 1 М 2-ами-но этанолом при pH 9 и комнатной температуре в течение 2 ч, в то же время после связывания на эпоксиактивированной сефарозе для инактивации в тех же условиях требуется 4 ч. Используется тот же буфер, что и при связывании, например 0,1 М. бикарбонат натрия, содержащий 0,5 моль/л хлорида натрия. Для бло- [c.216]

Если в качестве аффинного лиганда используется кофактор, согласно данным Лоу и Дина [57], очень важно, чтобы нативная конформация, кофактора сохранялась даже после его связывания. Это справедливо также в том случае, если аффинным лигандом является биологически активный белок. Он должен быть присоединен к носителю минимально возможным числом связей, так как при этом увеличивается вероятность сохранения нативной третичной структуры белка. В качестве примера приведем работу Куатреказаса по выделению инсулина [14] на колонке с сефарозой с присоединенными при pH 6,5 или 9,5 антителами к свиному инсулину. Как будет показано ниже, белок связывается с активированной бромцианом сефарозой посредством непротонированных аминогрупп. Снижение pH уменьшает число связавшихся групп. Различия в величинах pH в процессе присоединения приводят к тому, что первое производное (pH 6,5) характеризуется почти 80%-ной теоретически возможной емкостью по инсулину, в то время как у второго производного (pH 9,5) эта емкость равна только 7%. Поскольку общее содержание белка одинаково в обоих случаях, второе производное должно содержать иммуноглобулин, который не способен [c.11]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология